إن توصيف بيئة الورم بشكل شامل أمر ضروري في أبحاث الأورام المناعية. هذا الفحص هو أول من يستخدم نماذج التعبير الصحي المستندة إلى الحمض النووي الريبي لقياس الخلايا المناعية في أنسجة الورم الصلبة. هذا الفحص تمكن الباحثين من الحصول على قياسات حساسة للغاية ومحددة من سياق المناعة في أنسجة الورم الصلبة FFB والجمع بين هذه النتائج في علامة حيوية متعددة الأبعاد.
جميع علاجات السرطان، وليس فقط العلاجات المناعية، تثير استجابة مناعية في موقع الورم الصلب. قياس هذه الاستجابة المناعية مهم لفهم تطور المرض والاستجابات العلاجية. يجمع هذا البروتوكول بين تقنيات إعداد مكتبة RNA التقليدية مع الالتقاط المستهدف.
في حين تستغرق وقتا طويلا، واتباع خطوات الغسيل ومراقبة نقاط التفتيش مراقبة الجودة على النحو المقترح مهم جدا للنجاح. بالنسبة لرنا المتحللة للغاية من عينات البارافين الثابتة ، قم بتجميع أول تفاعل توليفي على الجليد وفقًا للجدول. خلط ردود الفعل بدقة عن طريق pipetting صعودا وهبوطا عدة مرات قبل الغزل لفترة وجيزة أسفل العينات في microcentrifuge.
في نهاية الطرد المركزي، ضع العينات على الفور في دورة حرارية مسخنة بعد البرنامج رقم ثلاثة من الجدول. بالنسبة للرنا السليم عالي الجودة، قم بتجميع أول تفاعل توليفي على الجليد في أنبوب PCR خال من النوى كما هو موضح في الجداول. لبدء هذا الإجراء، مزيج 200 نانوغرام من مكتبة ذات أهمية الباركود مع اثنين من ميكروغرام من الحمض النووي COT-1 واثنين من ميكرولترات من حجب oligos في أنبوب PCR خالية من النوى.
ثم استخدام فراغ المكثف تعيين إلى 30 إلى 45 درجة مئوية لتجفيف محتويات الأنبوب. بعد التهجين، وإزالة العينات من دورة الحرارية وتعيين دورة الحرارية لاحتضان في 65 درجة مئوية مع غطاء ساخنة تعيين إلى 70 درجة مئوية. استخدام ماصة متعددة القنوات لنقل 17 ميكروليترس من الخرز متجانسة تماما إلى العينات وماصة جيدا صعودا وهبوطا 10 مرات.
لربط الحمض النووي إلى الخرز، ووضع الأنابيب في دورة الحرارية بعد البرنامج 10 إزالة لفترة وجيزة الأنابيب جردت كل 10 إلى 12 دقيقة لمدة ثلاث ثوان من دوامة لطيف للحفاظ على حبات resuspended. مباشرة بعد حضانة ملزمة، وإزالة شريط واحد من الأنابيب من دورة الحرارية وإضافة 100 ميكرولترات من العازلة غسل مسخة مسبقا واحدة إلى الأنابيب. الماصات جيدا صعودا وهبوطا 10 مرات ووضع الأنابيب على رف المغناطيسي للسماح الخرز لفصل تماما عن محلول الغسيل قبل التعرق الحمض النووي غير منضم التي تحتوي على افراط.
إزالة الأنابيب من الرف وإضافة 150 ميكروليترات من العازلة غسل صارمة مسخدة مع خلط شامل لإعادة ربط تماما الخرز مع الحرص على تجنب فقاعات. ضع الأنابيب مرة أخرى في الدورة الحرارية في 65 درجة مئوية لمدة خمس دقائق قبل وضع الأنابيب مرة أخرى على الرف المغناطيسي للسماح للخرز لفصل كامل عن اابر. تجاهل الحمض النووي غير منضم التي تحتوي على اغحام، وغسل الخرز مرة أخرى مع العازلة غسل صارمة مسخن كما أظهرت للتو لمجموع اثنين من يغسل صارمة.
بعد الغسيل الأخير، وإزالة عظمى وإضافة 150 ميكرولترات من درجة حرارة الغرفة غسل العازلة واحدة إلى الأنابيب. Pipette غسل 10 إلى 20 مرة لإعادة تماما حبات واحتضان العينات مع غطاء مختومة لمدة دقيقتين بالتناوب بين دوامة لمدة 30 ثانية والراحة لمدة 30 ثانية. في نهاية الحضانة، الطرد المركزي لفترة وجيزة ووضع الأنابيب على الرف المغناطيسي وإزالة فائقة مرة واحدة قد التزمت تماما الخرز إلى المغناطيس.
أغلقت أجهزة الطرد المركزي الأنابيب لفترة وجيزة مع قبعات مغلقة والعودة العينات إلى الرف المغناطيسي. استخدام ماصة 10 ميكروليتر لإزالة أي العازلة غسل المتبقية وإضافة 150 ميكروليتر من درجة حرارة الغرفة غسل العازلة اثنين. Pipette غسل 10 إلى 20 مرة لإعادة تعليق تماما الخرز واحتضان العينات مع الأغطية مختومة لمدة دقيقتين بالتناوب بين دوامة لمدة 30 ثانية والراحة لمدة 30 ثانية.
بعد طرد مركزي قصير، قم بنقل كامل حجم الخرز من كل أنبوب إلى أنابيب PCR خالية من النيوكلازات النظيفة ووضع الأنابيب على الحامل المغناطيسي. بعد التخلص من الحمض النووي غير المنضم الذي يحتوي على ملوثات فوقية ، طرد مركزي لفترة وجيزة العينات مرة أخرى واستخدام ماصة 10 ميكرولتر لإزالة أي عازلة الغسيل المتبقية من الخرز أثناء وجودهم في الرف المغناطيسي. إضافة 150 microliters من غسل العازلة ثلاثة إلى الأنابيب والماصات صعودا وهبوطا 10 إلى 20 مرة لإعادة ربط تماما الخرز.
احتضان الأنبوب لمدة دقيقتين بالتناوب بين 30 ثانية من دوامة لطيف و 30 ثانية من الراحة قبل الطرد المركزي لفترة وجيزة. ضع الأنابيب على الحامل المغناطيسي لpirate المابير والطرد المركزي لفترة وجيزة عينات الخرزة مرة أخرى. استخدام ماصة 10 ميكروليتر لإزالة أي عازلة غسل المتبقية من الخرز أثناء وجودهم في الرف المغناطيسي قبل إزالة الأنابيب من الرف وإعادة ربط الخرز في 20 ميكرولترات من المياه خالية من النوى لكل أنبوب.
ثم الماصات الخرز 10 مرات لضمان أن أي حبات عالقة إلى جانب الأنابيب قد تم resuspended. يجب تقييم وجود خافمات المحول لتحديد ما إذا كان التنظيف إضافية ضروري. على سبيل المثال، يظهر هذا المخطط الكهربائي مستوى مقبول من خافض المحول الذي يظهر كذرية حادة حول أزواج قاعدة 128 بينما يظهر هذا المخطط الكهربائي مستوى غير مقبول من خافتر محول.
يمكن استخدام ملفات تعريف المناعة قبل العلاج وما بعده لفهم آثار العلاج المحدد على البيئة الدقيقة للورم كما هو الحال في هذا التحليل التمثيلي الذي تظهر التغيرات في النسبة المئوية لكل خلية مناعية ذات فائدة والمحتوى المناعي الكلي قبل العلاج الكيميائي وما بعده لمريض واحد. في هذا التحليل، تم مقارنة العينات بين مجموعات المرضى وفقا لوقتهم لتطور المرض بعد العلاج. وأظهرت مجموعة فرعية من المرضى تكرار المرض بعد 18 شهرا في حين تقدمت مجموعة فرعية أخرى بشكل أسرع في 18 شهرا أو أقل.
ويمكن بعد ذلك مقارنة قيمة دلتا الوسط لكل عينة لتحديد المؤشرات البيولوجية المفترضة لتطور المرض. على سبيل المثال، تم تحديد جينين مناعيين للهروب من الفئات على أنها مختلفة ذات دلالة إحصائية لمجموعات العينات. ولأن المؤشرات البيولوجية الجينية الفردية كانت قوية ذات أهمية إحصائية واضحة، فإن العلامة الحيوية المتعددة الأبعاد لم تضيف قيمة تنبؤية كبيرة.
تأكد من إجراء غسلات ساخنة شريط واحد في وقت واحد لمنع تبريد العينة وتذكر لنقل الخرز إلى أنابيب جديدة لتجنب التلوث خارج الهدف. يوضح هذا البروتوكول استخدام نماذج التعبير الجيني لتحديد الخلايا المناعية والأنسجة السرطانية. ويجري حاليا وضع نماذج جديدة لقياس حالات الخلية مثل الإرهاق أو التنشيط.
