腫瘍微小環境を総合的に特徴付けるのが免疫腫瘍学研究に不可欠です。このアッセイは、固形腫瘍組織の免疫細胞を測定するためにRNAベースの健康発現モデルを使用する最初のものである。このアッセイにより、FFB固形腫瘍組織における免疫コンテクスチャの高感度かつ特異的な測定を行い、これらの結果を多次元バイオマーカーに組み合わせることができます。
免疫療法だけでなく、すべてのがん治療は、固形腫瘍の部位で免疫応答を引き出します。この免疫応答を測定することは、疾患の進行と治療応答を理解するために重要です。このプロトコルは、従来のRNAライブラリ調製技術と標的捕捉を組み合わせたものです。
時間はかかりますが、洗浄手順に従い、提案された品質管理チェックポイントを監視することは、成功のために非常に重要です。ホルマリン固定パラフィン埋め込みサンプルから高度に分解されたRNAの場合、表に従って氷上で最初のストランド合成反応を組み立てます。マイクロ遠心分離機でサンプルを短時間回転させる前に、数回上下にピペット処理して反応を徹底的に混合します。
遠心分離の終わりに、すぐにテーブルからプログラム番号3に続いて予熱サーマルサイクラーにサンプルを入れます。高品質の無傷のRNAを得る場合は、表に示すように、ヌクレアーゼを含まないPCRチューブで氷上で初めてストランド合成反応を組み立てます。この手順を開始するには、目的のバーコードライブラリの200ナノグラムを、COT-1 DNAの2マイクログラムとヌクレアーゼフリーPCRチューブ内の2マイクロリットルのブロッキングオリゴと混合します。
その後、真空濃縮器を30~45°Cに設定して、チューブの内容物を乾燥させます。ハイブリダイゼーションの後、サーマルサイクラーからサンプルを取り出し、加熱された蓋を摂氏70度に設定して摂氏65度でインキュベートするようにサーマルサイクラーを設定します。マルチチャンネルピペットを使用して、17マイクロリットルの完全に均質化されたビーズをサンプルに転送し、ピペットを10回徹底的に上下に移動させます。
DNAをビーズに結合するには、プログラム10に続いてチューブをサーマルサイクラーに入れ、10〜12分ごとに剥がされたチューブを3秒間穏やかな渦を取り除き、ビーズを再懸濁させたままにします。結合インキュベーションの直後に、サーマルサイクラーからチューブのストリップを1つ取り除き、100マイクロリットルの予熱洗浄バッファーをチューブに加えます。ピペットは10回徹底的に上下し、上清を含む非結合DNAを吸引する前にビーズが洗浄液から完全に分離できるように、磁気ラックにチューブを置きます。
ラックからチューブを取り外し、十分に混合して150マイクロリットルの予熱されたストリージェント洗浄バッファーを加え、気泡を避けるために注意してビーズを完全に再中断します。チューブを摂氏65度で5分間サーマルサイクラーに戻してから、チューブを磁気ラックに戻して、ビーズを上清から完全に分離できるようにします。上清を含む非結合DNAを捨て、合計2回のストリンウォッシュで実証したように、ビーズを予熱されたストリンジェント洗浄バッファーでもう一度洗います。
最後の洗浄後、上清を取り除き、150マイクロリットルの室温洗浄バッファーをチューブに加えます。洗浄を10〜20回ピペットし、ビーズを完全に再懸濁し、蓋を密閉して2分間、渦を30秒間交互に、30秒間休ませる状態でサンプルをインキュベートする。インキュベーションの終わりには、遠心分離機を短くし、マグネットラックにチューブを置き、ビーズが完全に磁石に付着したら上清を取り外します。
キャップを閉じた状態でチューブを遠心分離し、サンプルを磁気ラックに戻します。10マイクロリットルのピペットを使用して、残留洗浄バッファーを取り除き、150マイクロリットルの室温洗浄バッファーを2個追加します。ピペット洗浄を10〜20回洗浄し、ビーズを完全に再懸濁し、蓋を2分間密閉して30秒間ボルテックスを交互に、30秒間休む状態でサンプルをインキュベートする。
短い遠心分離の後、各チューブからビードの全容をクリーンヌクレアーゼフリーPCRチューブに移し、チューブを磁気ラックに置きます。上清を含むバインドされていないDNAを捨て、サンプルを再び一時的に遠心分離し、10マイクロリットルのピペットを使用して、磁気ラックにいる間にビーズから残留洗浄バッファーを取り除きます。150マイクロリットルの洗浄バッファーをチューブに3マイクロリットル加え、ピペットを10~20回上下に加え、ビーズを完全に再懸濁します。
穏やかな渦の30秒と30秒の休息の間で交互に2分間チューブをインキュベートしてから、一時的に遠心分離します。チューブを磁気ラックに置いて上清を吸引し、ビーズサンプルを再び短く遠心分離します。10マイクロリットルのピペットを使用して、磁気ラックに入っている間に残りの洗浄バッファーを取り除き、ラックからチューブを取り外し、チューブあたり20マイクロリットルのヌクレアーゼフリー水でビーズを再懸濁します。
その後、ビーズを10回ピペットし、チューブの側面に貼り付けたビーズが再懸濁されていることを確認します。アダプターダイマーの存在を評価して、追加のクリーンアップが必要かどうかを判断する必要があります。例えば、このエレクトロフェログラムは、アダプタダイマーの許容レベルを示し、128塩基対の周りに鋭いピークとして現れ、このエレクトロフェログラムはアダプタダイマーの許容できないレベルを示しています。
免疫プロファイルの前および後の処置は、関心のある各免疫細胞の割合の変化および全免疫含有量が単一の患者に対する化学療法前および後に示されるこの代表的な分析と同様に、腫瘍微小環境に対する特定の治療の影響を理解するために使用され得る。この分析では、患者群間のサンプルを、治療後の疾患進行までの時間に従って比較した。患者のサブセットは18ヶ月後に疾患再発を示し、別のサブセットは18ヶ月以下でより速く進行した。
その後、中央値のデルタ値を各サンプルについて比較して、疾患進行の推定バイオマーカーを同定することができます。例えば、ここで2つの免疫エスケープ遺伝子が、サンプル群の統計的に有意な区別因子として同定された。個々の遺伝子バイオマーカーは明確な統計的有意性を有する堅牢であったため、多次元バイオマーカーは有意な予測値を追加しなかった。
サンプル冷却を防ぐために一度に1つのストリップに加熱された流しを実行し、オフターゲット汚染を避けるために新鮮なチューブにビーズを転送することを忘れないでください。このプロトコルは、免疫細胞および腫瘍組織を定量化するための遺伝子発現モデルの使用を実証する。疲労や活性化などの細胞状態を測定する新しいモデルが開発されています。
