La caractérisation complète du microenvironnement tumoral est essentielle dans la recherche en immuno-oncologie. Cet essai est le premier à utiliser des modèles d’expression de santé basés sur l’ARN pour mesurer les cellules immunitaires dans le tissu tumoral solide. Cet essai permet aux chercheurs d’obtenir des mesures très sensibles et spécifiques de la contexturation immunitaire dans les tissus tumoraux solides FFB et de combiner ces résultats en un biomarqueur multidimensionnel.
Tous les traitements contre le cancer, pas seulement les immunothérapies, provoquent une réponse immunitaire à l’emplacement de la tumeur solide. La mesure de cette réponse immunitaire est importante pour comprendre la progression de la maladie et les réponses thérapeutique. Ce protocole combine les techniques traditionnelles de préparation de la bibliothèque d’ARN avec la capture ciblée.
Bien que long, suivre les étapes de lavage et surveiller les points de contrôle de la qualité comme suggéré est très important pour le succès. Pour l’ARN fortement dégradé provenant d’échantillons incorporés de paraffine fixe à la formaline, assemblez la première réaction de synthèse des brins sur la glace selon le tableau. Bien mélanger les réactions en descendant plusieurs fois avant de faire tourner brièvement les échantillons dans une microcentrifugeuse.
À la fin de la centrifugation, placez immédiatement les échantillons dans un cycleur thermique préchauffé suivant le programme numéro trois de la table. Pour un ARN intact de haute qualité, assemblez la première réaction de synthèse des brins sur la glace dans un tube PCR sans nucléase tel que décrit dans les tableaux. Pour commencer cette procédure, mélangez 200 nanogrammes de la bibliothèque d’intérêt codée à barres avec deux microgrammes d’ADN COT-1 et deux microlitres d’oligos bloquants dans un tube PCR sans nucléase.
Ensuite, utilisez un concentrateur sous vide réglé à 30 à 45 degrés Celsius pour sécher le contenu du tube. Après hybridation, retirez les échantillons du cycleur thermique et réglez le cycleur thermique à incuber à 65 degrés Celsius avec le couvercle chauffé fixé à 70 degrés Celsius. Utilisez une pipette multicanal pour transférer 17 microlitres de perles entièrement homogénéisées aux échantillons et pipette complètement de haut en bas 10 fois.
Pour lier l’ADN aux perles, placez les tubes dans le cycleur thermique suivant le programme 10 en enlevant brièvement les tubes dépouillés toutes les 10 à 12 minutes pendant trois secondes de vortex doux pour garder les perles résuspendus. Immédiatement après l’incubation de liaison, retirer une bande de tubes du cycleur thermique et ajouter 100 microlitres de tampon de lavage préchauffé aux tubes. Pipette complètement de haut en bas 10 fois et placer les tubes sur une grille magnétique pour permettre aux perles de se séparer complètement de la solution de lavage avant d’aspirer l’ADN non lié contenant du surnatant.
Retirer les tubes de la grille et ajouter 150 microlitres de tampon de lavage rigoureux préchauffé avec un mélange complet pour résuspendre complètement les perles en prenant soin d’éviter les bulles. Remettre les tubes dans le cycleur thermique à 65 degrés Celsius pendant cinq minutes avant de remettre les tubes sur la grille magnétique pour permettre aux perles de se séparer complètement des surnatants. Jetez l’ADN non lié contenant des supernatants, lavez les perles une fois de plus avec un tampon de lavage rigoureux préchauffé comme il vient de le démontrer pour un total de deux lavages rigoureux.
Après le dernier lavage, retirer le supernatant et ajouter 150 microlitres de tampon de lavage à température ambiante aux tubes. Pipette le lavage 10 à 20 fois pour résusquer complètement les perles et incuber les échantillons avec le couvercle scellé pendant deux minutes en alternant entre le vortex pendant 30 secondes et le repos pendant 30 secondes. À la fin de l’incubation, centrifugeuse brièvement et placer les tubes sur la grille magnétique et enlever le supernatant une fois que les perles ont pleinement adhéré à l’aimant.
Centrifuger brièvement les tubes avec les bouchons fermés et retourner les échantillons à la grille magnétique. Utilisez une pipette de 10 microlitres pour éliminer tout tampon de lavage résiduel et ajoutez 150 microlitres de tampon de lavage à température ambiante deux. Pipette le lavage 10 à 20 fois pour résusquer complètement les perles et incuber les échantillons avec les couvercles scellés pendant deux minutes en alternant entre le vortex pendant 30 secondes et le repos pendant 30 secondes.
Après une brève centrifugation, transférer tout le volume de perles de chaque tube dans des tubes PCR propres sans nucléase et placer les tubes sur le support magnétique. Après avoir jeté l’ADN non lié contenant des supernatants, centrifugez brièvement les échantillons à nouveau et utilisez une pipette de 10 microlitres pour enlever tout tampon de lavage résiduel des perles pendant qu’ils sont dans la grille magnétique. Ajouter 150 microlitres de tampon de lavage trois aux tubes et pipette de haut en bas 10 à 20 fois pour résuspendre complètement les perles.
Incuber le tube pendant deux minutes en alternant entre 30 secondes de vortex doux et 30 secondes de repos avant de centrifuger brièvement. Placez les tubes sur la grille magnétique pour aspirer les supernatants et centrifugez brièvement les échantillons de perles à nouveau. Utilisez une pipette de 10 microlitres pour enlever tout tampon de lavage résiduel des perles pendant qu’elles sont dans la grille magnétique avant d’enlever les tubes de la grille et de réutiliser les perles dans 20 microlitres d’eau sans nucléase par tube.
Puis pipette les perles 10 fois pour s’assurer que toutes les perles collées sur le côté des tubes ont été résuspendus. La présence de dimers adaptateur doit être évaluée pour déterminer si un nettoyage supplémentaire est nécessaire. Par exemple, cet électrophétogramme montre un niveau acceptable de dimère adaptateur qui apparaît comme un pic aigu autour de 128 paires de base tandis que cet électrophétogramme montre un niveau inacceptable de dimère adaptateur.
Les profils immunitaires avant et après le traitement peuvent être utilisés pour comprendre les effets d’une thérapie spécifique sur le microenvironnement tumoral comme dans cette analyse représentative pour laquelle les changements de pourcentage pour chaque cellule immunitaire d’intérêt et la teneur immunitaire totale sont montrés avant et après la chimiothérapie pour un seul patient. Dans cette analyse, des échantillons entre les groupes de patients ont été comparés selon leur temps à la progression de la maladie après traitement. Un sous-ensemble des patients a montré la répétition de la maladie après 18 mois tandis qu’un autre sous-ensemble a progressé plus rapidement en 18 mois ou moins.
La valeur médiane du delta pourrait alors être comparée pour chaque échantillon afin d’identifier les biomarqueurs putatifs de la progression de la maladie. Par exemple, ici, deux gènes d’évasion immunitaire ont été identifiés comme différenciateurs statistiquement significatifs des groupements d’échantillons. Puisque les biomarqueurs individuels de gène étaient robustes avec la signification statistique claire, le biomarqueur multidimensionnel n’a pas ajouté la valeur prédictive significative.
Assurez-vous d’effectuer les lavages chauffés une bande à la fois pour empêcher le refroidissement de l’échantillon et n’oubliez pas de transférer les perles dans des tubes frais pour éviter la contamination hors cible. Ce protocole démontre l’utilisation de modèles d’expression génétique pour quantifier les cellules immunitaires et les tissus tumoraux. De nouveaux modèles sont en cours de développement pour mesurer les états cellulaires tels que l’épuisement ou l’activation.
