Всеобъемлющая характеристика микроокноронности опухоли имеет важное значение в иммуноонкологии исследований. Этот анализ является первым использовать РНК на основе моделей выражения здоровья для измерения иммунных клеток в твердой опухолевой ткани. Этот анализ позволяет исследователям получить очень чувствительные и специфические измерения иммунного контекста в твердых опухолевых тканях FFB и объединить эти результаты в многомерный биомаркер.
Все методы лечения рака, а не только иммунотерапии, вызывают иммунный ответ в месте твердой опухоли. Измерение этого иммунного ответа имеет важное значение для понимания прогрессирования заболевания и реакции терапии. Этот протокол сочетает в себе традиционные методы подготовки библиотеки РНК с целевым захватом.
В то время как много времени, после мытья шаги и мониторинг контроля качества контрольно-пропускных пунктов, как это предлагается, очень важно для успеха. Для сильно деградированной РНК из формалин-фиксированных парафин встроенных образцов, собрать первую реакцию синтеза нити на льду в соответствии с таблицей. Тщательно смешать реакции, трубя вверх и вниз несколько раз, прежде чем кратко спиннинг вниз образцов в микроцентрифуге.
В конце центрифуги немедленно поместите образцы в разогретый тепловой циклер по программе номер три со стола. Для высококачественной нетронутой РНК, собрать первую реакцию синтеза нити на льду в нуклеазной ПЦР трубки, как указано в таблицах. Чтобы начать эту процедуру, смешайте 200 нанограммов библиотеки штрих-кодов, представляющих интерес, с двумя микрограммами ДНК COT-1 и двумя микролитровами блокирующих олиго в нуклеазной трубке ПЦР.
Затем используйте вакуумный концентратор, установленный на 30-45 градусов по Цельсию, чтобы высушить содержимое трубки. После гибридизации удалите образцы из теплового цикла и установите тепловой циклер для инкубации при 65 градусах Цельсия с нагретой крышкой, установленной до 70 градусов по Цельсию. Используйте многоканальный пипетку для передачи 17 микролитров полностью однородных бусин в образцы и пипетку вверх и вниз в 10 раз.
Чтобы связать ДНК с бисером, поместите трубки в тепловой циклер после программы 10 кратко удаления раздели трубки каждые 10 до 12 минут в течение трех секунд нежный вихрь держать бисер повторно. Сразу же после переплета инкубации снимите одну полоску трубок с теплотрассы и добавьте 100 микролитров разогретого буфера для мытья в трубы. Pipette тщательно вверх и вниз 10 раз и поместите трубки на магнитной стойке, чтобы бисер полностью отделиться от раствора мытья, прежде чем аспирировать несъегодные ДНК, содержащие супернатант.
Удалите трубки из стойки и добавить 150 микролитров разогретого строгого буфера мытья с тщательной смешивания, чтобы полностью повторно бусинки заботиться, чтобы избежать пузырьков. Поместите трубки обратно в тепловой циклер при 65 градусах по Цельсию в течение пяти минут, прежде чем поместить трубки обратно на магнитную стойку, чтобы бусы полностью отделились от супернатантов. Отбросьте несъединую ДНК, содержащую супернатанты, мыть бисер еще раз с разогретым строгим буфером мытья, как только что продемонстрировано в общей сложности два строгих моет.
После последней стирки снимите супернатант и добавьте в трубки 150 микролитров буфера комнатной температуры. Pipette мыть от 10 до 20 раз, чтобы полностью повторно использовать бисер и инкубировать образцы с крышкой запечатаны в течение двух минут чередующихся между вихрем в течение 30 секунд и отдыха в течение 30 секунд. В конце инкубации, центрифуга кратко и поместите трубки на магнитной стойке и удалить супернатант, как только бисер полностью прилип к магниту.
Центрифуга труб кратко с крышками закрыты и вернуть образцы в магнитной стойке. Используйте 10 микролитровый пипетку, чтобы удалить любой остаточный буфер мытья и добавить 150 микролитров буфера мытья комнатной температуры два. Pipette мыть от 10 до 20 раз, чтобы полностью повторно beads и инкубировать образцы с крышками запечатаны в течение двух минут чередующихся между вихрем в течение 30 секунд и отдыха в течение 30 секунд.
После краткой центрифугации перенесите весь объем бисера из каждой трубки в чистые трубы ПЦР без ядра и поместите трубки на магнитную стойку. После отбрасывания несъегодной ДНК, содержащей супернатанты, кратко центрифуга образцов снова и использовать 10 микролитер пипетки для удаления любого остаточного буфера мытья из бисера, пока они находятся в магнитной стойке. Добавьте 150 микролитров буфера мытья три к трубам и пипетке вверх и вниз от 10 до 20 раз, чтобы полностью повторно использовать бисер.
Инкубировать трубку в течение двух минут чередующихся между 30 секунд нежной вихревой и 30 секунд отдыха, прежде чем кратко центрифугирования. Поместите трубки на магнитную стойку, чтобы аспирировать супернатанты и кратко центрифугировать образцы бисера снова. Используйте 10 микролитровую пипетку, чтобы удалить любой остаточный буфер мытья из бисера, пока они находятся в магнитной стойке, прежде чем удалить трубки из стойки и повторного использования бисера в 20 микролитров нуклеазной воды на трубку.
Затем пипетки бусы 10 раз, чтобы убедиться, что любые бусы застряли в сторону труб были повторно. Наличие адаптера димеры должны быть оценены, чтобы определить, если дополнительная очистка необходима. Например, эта электроферограмма показывает приемлемый уровень адаптера димер, который появляется как резкий пик около 128 базовых пар в то время как эта электроферограмма показывает неприемлемый уровень адаптера димер.
Иммунные профили до и после лечения могут быть использованы для понимания влияния конкретной терапии на микросреду опухоли, как в этом репрезентативном анализе, для которого изменения в процентном соотношении для каждой иммунной клетки, представляющие интерес и общее содержание иммунной показаны до и после химиотерапии для одного пациента. В этом анализе образцы между группами пациентов сравнивались в зависимости от их времени до прогрессирования заболевания после лечения. Подмножество пациентов показали рецидив заболевания после 18 месяцев, в то время как другой подмножество прогрессировал быстрее в 18 или менее месяцев.
Затем среднее значение дельты можно сравнить по каждому образцу для выявления если идентифицировать биохимические знаки прогрессирования заболевания. Например, здесь два гена иммунного побега были определены как статистически значимые юбилиаторы групп образцов. Поскольку отдельные биомаркеры генов были надежными с четкой статистической значимостью, многомерный биомаркер не добавлял значительного прогностический значение.
Будьте уверены, чтобы выполнить подогревом моет одну полоску в то время, чтобы предотвратить охлаждение образца и не забудьте передать бисер в свежие трубки, чтобы избежать внецелевых загрязнения. Этот протокол демонстрирует использование моделей экспрессии генов для количественной оценки иммунных клеток и опухолевых тканей. Разрабатываются новые модели для измерения состояния клеток, такие как истощение или активация.
