Caratterizzare in modo completo il microambiente tumorale è essenziale nella ricerca immuno-oncologica. Questo test è il primo a utilizzare modelli di espressione della salute basati sull'RNA per misurare le cellule immunitarie nel tessuto tumorale solido. Questo test consente ai ricercatori di ottenere misurazioni altamente sensibili e specifiche della contestualità immunitaria nei tessuti tumorali solidi FFB e di combinare questi risultati in un biomarcatore multidimensionale.
Tutti i trattamenti contro il cancro, non solo le immunoterapie, suscitano una risposta immunitaria nel sito del tumore solido. Misurare questa risposta immunitaria è importante per comprendere la progressione della malattia e le risposte terapeutiche. Questo protocollo combina le tradizionali tecniche di preparazione della libreria di RNA con l'acquisizione mirata.
Sebbene dispendioso in termini di tempo, seguire le fasi di lavaggio e monitorare i checkpoint di controllo qualità come suggerito è molto importante per il successo. Per l'RNA altamente degradato da campioni incorporati di paraffina fissa alla formalina, assemblare la prima reazione di sintesi del filamento sul ghiaccio secondo la tabella. Mescolare accuratamente le reazioni pipettando su e giù più volte prima di girare brevemente i campioni in un microcentrifugo.
Al termine della centrifugazione, posizionare immediatamente i campioni in un ciclore termico preriscaldato seguendo il programma numero tre dalla tabella. Per l'RNA intatto di alta qualità, assemblare la prima reazione di sintesi del filamento sul ghiaccio in un tubo PCR privo di nucleasi come delineato nelle tabelle. Per iniziare questa procedura, mescolare 200 nanogrammi della libreria di interesse codificata a barre con due microgrammi di DNA COT-1 e due microlitri di oligo bloccanti in un tubo PCR privo di nucleasi.
Quindi utilizzare un concentratore sottovuoto impostato su 30-45 gradi Celsius per asciugare il contenuto del tubo. Dopo l'ibridazione, rimuovere i campioni dal ciclore termico e impostare il ciclore termico in modo da incubare a 65 gradi Celsius con il coperchio riscaldato impostato su 70 gradi Celsius. Utilizzare una pipetta multicanale per trasferire 17 microlitri di perline completamente omogeneizzate sui campioni e pipettare accuratamente su e giù 10 volte.
Per legare il DNA alle perline, posizionare i tubi nel ciclore termico seguendo il programma 10 rimuovendo brevemente i tubi spogliati ogni 10-12 minuti per tre secondi di vortice delicato per mantenere le perline rimonite. Immediatamente dopo l'incubazione di legame, rimuovere una striscia di tubi dal ciclore termico e aggiungere 100 microlitri di tampone di lavaggio preriscaldato uno ai tubi. Pipettare accuratamente su e giù 10 volte e posizionare i tubi su un rack magnetico per consentire alle perline di separarsi completamente dalla soluzione di lavaggio prima di aspirare il DNA non legato contenente supernatante.
Rimuovere i tubi dal rack e aggiungere 150 microlitri di tampone di lavaggio rigoroso preriscaldato con miscelazione accurata per rimescolare completamente le perline facendo attenzione ad evitare bolle. Riposizionare i tubi nel ciclore termico a 65 gradi Celsius per cinque minuti prima di riposizionare i tubi sul rack magnetico per consentire alle perline di separarsi completamente dai supernatanti. Scartare il DNA non legato contenente supernatanti, lavare ancora una volta le perline con un rigoroso tampone di lavaggio preriscaldato, come appena dimostrato per un totale di due lavaggi rigorosi.
Dopo l'ultimo lavaggio, rimuovere il supernatante e aggiungere 150 microlitri di tampone di lavaggio a temperatura ambiente uno ai tubi. Pipettare il lavaggio da 10 a 20 volte per riprestare completamente le perline e incubare i campioni con il coperchio sigillato per due minuti alternando tra vortice per 30 secondi e riposo per 30 secondi. Alla fine dell'incubazione, centrifugare brevemente e posizionare i tubi sul rack magnetico e rimuovere il supernatante una volta che le perline hanno aderito completamente al magnete.
Centrifugare brevemente i tubi con i tappi chiusi e riportare i campioni al rack magnetico. Utilizzare una pipetta da 10 microlitri per rimuovere qualsiasi tampone di lavaggio residuo e aggiungere 150 microlitri di tampone di lavaggio a temperatura ambiente due. Pipettare il lavaggio da 10 a 20 volte per riprestare completamente le perline e incubare i campioni con i coperchi sigillati per due minuti alternando il vortice per 30 secondi e riposando per 30 secondi.
Dopo una breve centrifugazione, trasferire l'intero volume di perline da ogni tubo in tubi PCR puliti senza nucleasi e posizionare i tubi sul rack magnetico. Dopo aver scartato il DNA non legato contenente supernatanti, centrifugare brevemente i campioni di nuovo e utilizzare una pipetta da 10 microliter per rimuovere qualsiasi tampone di lavaggio residuo dalle perline mentre si trova nel rack magnetico. Aggiungere 150 microlitri di tampone di lavaggio tre ai tubi e pipetta su e giù da 10 a 20 volte per rimpioderare completamente le perline.
Incubare il tubo per due minuti alternando tra 30 secondi di vortice delicato e 30 secondi di riposo prima di centrifugarsi brevemente. Posizionare i tubi sul rack magnetico per aspirare i supernatanti e centrifugare brevemente nuovamente i campioni di perline. Utilizzare una pipetta da 10 microlitri per rimuovere qualsiasi tampone di lavaggio residuo dalle perline mentre si trovano nel rack magnetico prima di rimuovere i tubi dal rack e rimescolare le perline in 20 microlitri di acqua senza nucleasi per tubo.
Quindi pipettare le perline 10 volte per assicurarsi che eventuali perline attaccate al lato dei tubi siano state riprenite. La presenza di dimeri adattatore deve essere valutata per determinare se è necessaria una pulizia aggiuntiva. Ad esempio, questo elettroferogramma mostra un livello accettabile di dimero dell'adattatore che appare come un picco acuto intorno a 128 coppie di basi mentre questo elettroferogramma mostra un livello inaccettabile di dimero dell'adattatore.
I profili immunitari pre e post-trattamento possono essere utilizzati per comprendere gli effetti di una terapia specifica sul microambiente tumorale come in questa analisi rappresentativa per la quale vengono mostrati i cambiamenti di percentuale per ogni cellula immunitaria di interesse e il contenuto immunitario totale pre e post-chemioterapia per un singolo paziente. In questa analisi, i campioni tra gruppi di pazienti sono stati confrontati in base al loro tempo alla progressione della malattia dopo il trattamento. Un sottoinsieme dei pazienti ha mostrato la recidiva della malattia dopo 18 mesi, mentre un altro sottoinsieme è progredito più velocemente in 18 o meno mesi.
Il valore del delta mediano potrebbe quindi essere confrontato per ciascun campione per identificare i biomarcatori putativi della progressione della malattia. Ad esempio, qui due geni di fuga immunitaria sono stati identificati come diversiatori statisticamente significativi dei raggruppamenti di campioni. Poiché i singoli biomarcatori genetici erano robusti con una chiara significatività statistica, il biomarcatore multidimensionale non aggiungeva un significativo valore predittivo.
Assicurarsi di eseguire i lavaggi riscaldati una striscia alla volta per evitare il raffreddamento del campione e ricordarsi di trasferire le perline in tubi freschi per evitare contaminazioni fuori bersaglio. Questo protocollo dimostra l'uso di modelli di espressione genica per quantificare le cellule immunitarie e il tessuto tumorale. Sono in fase di sviluppo nuovi modelli per misurare gli stati delle celle come l'esaurimento o l'attivazione.
