肿瘤微环境的综合特征性在免疫肿瘤学研究中至关重要。该检测是首次使用基于RNA的健康表达模型测量实体肿瘤组织的免疫细胞。该检测使研究人员能够获得FFB实体肿瘤组织中免疫背景高度敏感和特异性的测量结果，并将这些结果组合成多维生物标志物。
所有的癌症治疗，不仅仅是免疫疗法，在实体肿瘤的位点引起免疫反应。测量这种免疫反应对于了解疾病进展和治疗反应很重要。该协议将传统的RNA库制备技术与目标捕获相结合。
虽然耗时，但按照洗涤步骤和按照建议监控质量控制检查点对成功非常重要。对于来自形式固定石蜡嵌入样品的高降解RNA，根据表在冰上组装第一股合成反应。在微离合中短暂地旋转样品之前，通过上下移液多次，彻底混合反应。
离心结束时，立即将样品放入表上程序 3 的预热热循环器中。对于高质量完整的RNA，将第一股合成反应组装在冰上，如表中所述的无核酸酶PCR管。为了开始这个程序，将感兴趣的条形码库的200纳米与两微克的COT-1 DNA和两微升的阻尼糖在无核酸酶管中。
然后使用设置为 30 至 45 摄氏度的真空浓缩器干燥管内装物。杂交后，从热循环器中去除样品，将热循环器设置为 65 摄氏度，加热盖设置为 70 摄氏度。使用多通道移液器将 17 微升完全均质的珠子转移到样品中，移液器可上下 10 次。
要将DNA与珠子结合，请按照程序10将管放入热循环器中，每10至12分钟短暂取出一根剥离的管子，进行三秒钟的温和涡旋，以保持珠子的重新暂停。在结合孵育后，立即从热循环器中去除一条管，并将 100 微升预热洗涤缓冲液一个添加到管中。移液器彻底上下10次，将管子放在磁架上，使珠子在吸出含有上清液的未绑定DNA之前，与洗涤溶液完全分离。
从机架上取下管子，加入 150 微升预热严格洗涤缓冲液，并彻底混合，以完全重新暂停珠子，避免气泡。将管子在 65 摄氏度下放回热循环器中 5 分钟，然后将管子放回磁架，使磁珠与超自然完全分离。丢弃含有超级纳酸剂的未绑定DNA，再次用预热的严格洗涤缓冲液清洗珠子，就像刚刚演示的总共两次严格洗涤一样。
最后一次洗涤后，取出上经剂，并在管中加入150微升室温洗涤缓冲液。移液洗涤10至20次，以完全重新暂停珠子，并用盖子密封孵育样品两分钟，在涡流之间交替30秒，休息30秒。在孵化结束时，将离心机短暂地放在磁架上，并在磁珠完全粘附到磁铁上后取出上流液。
在盖关闭时将管短暂离离，然后将样品返回磁架。使用 10 微升移液器去除任何残留洗涤缓冲液，并添加 150 微升的室温洗涤缓冲液 2。移液洗涤10至20次，以完全重新暂停珠子，并用盖子密封两分钟孵育样品，在涡流之间交替30秒，休息30秒。
短暂离心后，将每个管的整个珠子体积转移到干净的无核酸酶 PCR 管中，然后将管放到磁架上。丢弃含有超自然物质的未绑定DNA后，再次短暂地将样品离心，并使用10微升移液器在磁架中去除珠子上残留的洗涤缓冲液。将 150 微升的洗涤缓冲液三个添加到管中，并上下移液器 10 到 20 次，以完全重新填充珠子。
在短暂离心前，在30秒的温和涡旋和30秒的休息之间孵育管子两分钟。将管子放在磁架上，以吸入超极物，并再次短暂地将珠子样品离心。使用 10 微升移液器在磁架中去除磁珠中残留的洗涤缓冲液，然后从机架上取出管子，然后每管将珠子重新悬浮在 20 微升无核酸酶水中。
然后移液珠子10次，以确保任何珠子卡在管的一侧已重新暂停。应评估适配器二丁首先是否存在，以确定是否需要进行其他清理。例如，此电图显示可接受的适配器二丁二百，该调子在 128 个基对附近显示为锐峰，而此电图显示适配器二丁车的不可接受的水平。
治疗前和治疗后免疫特征可用于了解特定治疗对肿瘤微环境的影响，如在此代表性分析中，每个感兴趣的免疫细胞的百分比变化和总免疫含量显示单个患者的化疗前和化疗后。在这项分析中，根据患者组之间的样本与治疗后疾病进展的时间进行比较。一部分患者在18个月后出现疾病复发，而另一部分在18个月或更小期间进展较快。
然后可以比较每个样本的中位增量值，以确定疾病进展的应定生物标志物。例如，这里两个免疫逃逸基因被确定为样本分组的统计显著差异。由于单个基因生物标志物具有明显的统计意义，多维生物标志物没有增加显著的预测价值。
确保一次进行一条加热洗涤，以防止样品冷却，并记得将珠子转移到新鲜管中，以避免脱靶污染。该协议演示了使用基因表达模型来量化免疫细胞和肿瘤组织。正在开发新的模型来测量细胞状态，如耗尽或激活。
