Este método permite a quantificação do consumo de oxigênio a partir de um pequeno número de ilhotas de espécies relevantes, como primatas não humanos e humanos, permitindo a avaliação da função mitocondrial. Essa técnica pode ser realizada com um pequeno número de ilhotas primárias, aumentando as réplicas técnicas, permitindo o teste de múltiplas condições, e melhorando o rigor e a reprodutibilidade do ensaio. Esta técnica avalia a saúde mitocondrial, um dos principais determinantes da função ilhota e da secreção de insulina que muitas vezes é prejudicada no diabetes e é um preditor significativo do transplante de ilhotas bem sucedido.
É essencial garantir que as ilhotas estejam localizadas no centro dos poços após a transferência. A não orealização resulta em medidas inconsistentes de consumo de oxigênio. Demonstrando este procedimento será, Valerie Ricciardi, uma estudante de graduação trabalhando no meu laboratório.
Um dia antes do ensaio, adicione 200 microliters de adesivo celular e tecido a 2,8 mililitros de 0,1 solução de bicarbonato de sódio molar e adicione 20 microlitadores da solução resultante ao fundo de cada poço de uma microplata de 96 poços esferoides. Certifique-se de que quaisquer bolhas de ar sejam removidas da ponta da pipeta. Quando todos os poços tiverem sido carregados, coloque a placa em uma incubadora de dióxido de carbono 37 graus Celsius.
Após uma hora, aspire a solução adesiva celular da placa dentro de um ambiente estéril e lave cada poço duas vezes com 400 microliters de 37 graus Celsius de água estéril. Em seguida, deixe os poços secarem por 30 a 40 minutos antes de cobrir a placa para armazenamento durante a noite a quatro graus Celsius. Para hidratar o cartucho do sensor, em um ambiente estéril abra a embalagem do cartucho do sensor e remova o conteúdo.
Coloque o cartucho do sensor de cabeça para baixo ao lado da placa do utilitário e encha cada poço da placa de utilidade com 200 microliters de água estéril. Quando todos os poços tiverem sido carregados, baixe o cartucho do sensor na placa do utilitário e coloque o cartucho do sensor montado e a placa de utilidade na incubadora de dióxido de carbono 37 graus Celsius durante a noite. No dia do ensaio, remova a tampa do cartucho do sensor e decante a água dos poços da placa de utilidade.
Adicione 200 mililitros de calibrante pré-armado a cada poço e substitua a tampa do cartucho do sensor. Em seguida, coloque o cartucho do sensor de volta na incubadora por cerca de uma hora. Para preparar as ilhotas para transferência, escolha a dedo as ilhotas em um prato de cultura celular de 60 por 15 milímetros contendo médio montado a quase 100% de pureza.
Quando todas as ilhotas forem coletadas, carregue cada poço da microplacar esferoide preparada com 175 microliters de meio montado e use uma pipeta P20 definida para 15 microliters para aspirar 15 ilhotas em 15 microliters de meio do prato de cultura celular. Para semear as ilhotas na microplacão esferoide, abaixe a ponta da pipeta até a parte inferior do poço, mal levante a ponta e dispense lentamente cerca de cinco microliters de médio. Para carregar as ilhotas nos poços, deixe que as ilhotas se instalem na ponta da pipeta antes de soltá-las suavemente acima da parte inferior do centro do poço em um pequeno volume de meio.
Confirme se todas as ilhotas deixaram a ponta da pipeta, verificando ocasionalmente a microplacão esferoide sob o microscópio para verificar se as ilhotas estão semeadas na parte inferior da placa e não grudadas nas laterais dos poços. Quando todas as ilhotas tiverem sido transferidas, coloque a microplaca na incubadora de dióxido de carbono Celsius de 37 graus Celsius. Antes de iniciar o procedimento de ensaio, carregue a Porta A do cartucho do sensor com 20 microliters de oligomicina micromolar recém-preparada, porta B com 22 microlitadores de 10 micromolares recém-preparados FCCP, e Porta C com 25 microliters de 25 micromolar rotenona AA. Em seguida, programe um ensaio analisador de fluxo extracelular para um período de respiração de 30 minutos na linha de base, período de medição de oligomicina de 42 minutos, período de 30 minutos de FCCP e período de AA rotenona de 30 minutos.
Em seguida, execute o ensaio seguindo as instruções na tela para calibrar o sensor e inserir a microplacão. Para a entrega de ilhotas na placa de ensaio, 15 ilhotas devem ser aspiradas em 15 microliters de médio como ilustrado. Esta técnica resultará na colocação consistente de ilhotas no centro inferior de cada poço de microplape permitindo medições precisas de consumo de oxigênio.
Neste experimento representativo mostrando o consumo de oxigênio de poços individuais, os poços foram mal carregados, resultando em um nível de base muito baixo de consumo de oxigênio e pouca ou nenhuma resposta à FCCP. Neste experimento, a maioria dos poços demonstrou uma respiração significativa da linha de base e resposta às drogas. No entanto, dois poços não apresentaram resposta à rotenona, sugerindo que a droga não foi devidamente liberada no poço.
Esses poços foram excluídos de análises posteriores. Aqui, os resultados de um ensaio bem sucedido em que os poços foram devidamente carregados com ilhotas e corretamente injetados com drogas podem ser observados. É benéfico preparar os reagentes e placas no dia anterior à realização do ensaio para permitir que as ilhotas sejam usadas logo após serem isoladas ou recebidas.
Após o ensaio, as ilhotas podem ser recuperadas para extração de proteína ou DNA para normalizar os dados de consumo de oxigênio ou quantificar o conteúdo do DNA mitocondrial. A capacidade de medir a função mitocondrial em um pequeno número de ilhotas primatas primárias permite o teste de múltiplas drogas e outras manipulações em uma única réplica biológica. Os indivíduos que trabalham com ilhotas primatas primárias devem ter certeza de serem treinados no manuseio adequado e seguro com esses tecidos.
Em particular, o uso de equipamentos de proteção individual adequados e o descarte adequado dessas amostras.
