Questo metodo consente la quantificazione del consumo di ossigeno da un piccolo numero di isolotti provenienti da specie rilevanti, come primati non umani e umani, consentendo la valutazione della funzione mitocondriale. Questa tecnica può essere eseguita con un piccolo numero di isolotti primari, aumentando le repliche tecniche, consentendo il test di più condizioni e migliorando il rigore e la riproducibilità del saggio. Questa tecnica valuta la salute mitocondriale, una delle principali determinazioni della funzione isolotto e della secrezione di insulina che è spesso compromessa nel diabete ed è un predittore significativo del trapianto di isolotto di successo.
È essenziale assicurarsi che gli isolotti siano localizzati al centro dei pozzi dopo il trasferimento. In caso di incapacità, si vengono effettuate misurazioni incoerenti del consumo di ossigeno. A dimostrare questa procedura sarà Valerie Ricciardi, studentessa universitaria che lavora nel mio laboratorio.
Il giorno prima del test, aggiungere 200 microlitri di adesivo cellulare e tissutale a 2,8 millilitri di soluzione di bicarbonato di sodio molare 0,1 e aggiungere 20 microlitri della soluzione risultante sul fondo di ogni pozzo di una micropiatta sferoide da 96 porri. Assicurarsi che eventuali bolle d'aria vengano rimosse dalla punta della pipetta. Quando tutti i pozzi sono stati caricati, posizionare la piastra in un incubatore di anidride carbonica non di 37 gradi Celsius.
Dopo un'ora, aspirare la soluzione adesiva cellulare dalla piastra all'interno di un ambiente sterile e lavare ogni bene due volte con 400 microlitri di acqua sterile di 37 gradi Celsius. Quindi lasciare asciugare i pozzi all'aria per 30-40 minuti prima di coprire la piastra per la conservazione notturna a quattro gradi Celsius. Per idratare la cartuccia del sensore, in un ambiente sterile aprire il pacchetto della cartuccia del sensore e rimuovere il contenuto.
Posizionare la cartuccia del sensore capovolta accanto alla piastra di utilità e riempire ogni pozzo della piastra di utilità con 200 microlitri di acqua sterile. Una volta caricati tutti i pozzi, abbassare la cartuccia del sensore nella piastra di utilità e posizionare la cartuccia del sensore assemblata e la piastra di utilità nell'incubatore di anidride carbonica non di 37 gradi Celsius durante la notte. Il giorno del test, rimuovere il coperchio della cartuccia del sensore e decantare l'acqua dai pozzi della piastra di utilità.
Aggiungere 200 millilitri di calibrant prebellici a ciascun pozzo e sostituire il coperchio della cartuccia del sensore. Quindi riposizionare la cartuccia del sensore nell'incubatore per circa un'ora. Per preparare gli isolotti per il trasferimento, raccogliere a mano gli isolotti in un piatto di coltura cellulare da 60 per 15 millimetri contenente mezzo assemblato fino a una purezza vicina al 100%.
Una volta raccolti tutti gli isolotti, caricare ogni pozzo della micropiastrina sferoide preparata con 175 microlitri di mezzo assemblato e utilizzare una pipetta P20 impostata su 15 microlitri per aspirare 15 isolotti in 15 microlitri di mezzo dal piatto di coltura cellulare. Per seminare gli isolotti sulla micropiastrina dello sferoide, abbassare la punta della pipetta sul fondo del pozzo, sollevare a malapena la punta e erogare lentamente circa cinque microlitri di mezzo. Per caricare gli isolotti nei pozzi, lasciare che gli isolotti si sistemino nella punta della pipetta prima di rilasciarli delicatamente direttamente sopra il fondo del centro del pozzo in un piccolo volume di mezzo.
Verificare che tutti gli isolotti abbiano lasciato la punta della pipetta, occasionalmente controllando la micropiastra sferoide al microscopio per verificare che gli isolotti siano seminati nella parte inferiore della piastra e non attaccati ai lati dei pozzi. Quando tutti gli isolotti sono stati trasferiti, posizionare la micropiastrina nell'incubatore di anidride carbonica non di 37 gradi Celsius. Prima di avviare la procedura di dosaggio, caricare la porta A della cartuccia del sensore con 20 microlitri di oligomicina micromolare appena preparata, la porta B con 22 microlitri di FCCP a 10 micromolari appena preparati e la porta C con 25 microlitri di rotenone AA a 25 micromolari appena preparati. Successivamente, programmare un test dell'analizzatore di flusso extracellulare per un periodo di respirazione di base di 30 minuti, un periodo di misurazione dell'oligomicina di 42 minuti, un periodo FCCP di 30 minuti e un periodo AA rotenone di 30 minuti.
Quindi eseguire il saggio seguendo le istruzioni sullo schermo per calibrare il sensore e inserire la micropiatta. Per la consegna dell'isolotto alla piastra di dosaggio, 15 isolotti devono essere aspirati in 15 microlitri di mezzo come illustrato. Questa tecnica si tradurrà nel posizionamento coerente degli isolotti al centro inferiore di ogni micropiastrina, consentendo accurate misurazioni del consumo di ossigeno.
In questo esperimento rappresentativo che mostra il consumo di ossigeno dei singoli pozzi, i pozzi sono stati caricati male, con il risultato di un livello di base molto basso di consumo di ossigeno e poca o nessuna risposta all'FCCP. In questo esperimento, la maggior parte dei pozzi ha dimostrato una significativa respirazione di base e una risposta ai farmaci. Tuttavia, due pozzi non mostravano alcuna risposta al rotenone, suggerendo che il farmaco non fosse stato correttamente rilasciato nel pozzo.
Questi pozzi sono stati esclusi da ulteriori analisi. Qui, si possono osservare i risultati di un saggio di successo in cui i pozzi sono stati correttamente caricati con isolotti e correttamente iniettati con farmaci. È utile preparare i reagenti e le piastre il giorno prima di eseguire il saggio per consentire l'uso degli isolotti poco dopo essere stati isolati o ricevuti.
Dopo il saggio, gli isolotti possono essere recuperati per l'estrazione di proteine o DNA per normalizzare i dati sul consumo di ossigeno o per quantificare il contenuto di DNA mitocondriale. La capacità di misurare la funzione mitocondriale in un piccolo numero di isolotti primati primari consente il test di più farmaci e altre manipolazioni in una singola replica biologica. Gli individui che lavorano con isolotti primati primari dovrebbero essere sicuri di essere addestrati nella manipolazione corretta e sicura con questi tessuti.
In particolare, l'uso di adeguati dispositivi di protezione individuale e il corretto smaltimento di tali campioni.
