非人类灵长类动物胰腺胰岛耗氧量分析

这种方法允许从来自相关物种（如非人类灵长类动物和人类）的少量小岛对氧气消耗进行定量，从而可以评估线粒体功能。这种技术可以在少量主岛的情况下执行，增加技术复制，允许测试多种条件，并提高测定的严格性和可重复性。这项技术评估线粒体健康，胰岛功能和胰岛素分泌的主要确定性，在糖尿病中经常受损，是成功胰岛移植的重要预测因素。

在转移后，必须确保小岛被本地化到井的中心。否则会导致耗氧量测量不一致。证明这个程序将是，瓦莱丽里恰尔迪，一个本科生在我的实验室工作。

在测定前一天，在2.8毫升0.1摩尔碳酸氢钠溶液中加入200微升的细胞和组织粘合剂，并在96孔球形微孔的每孔底部加入20微升所产生的溶液。确保从移液器尖端清除任何气泡。当所有油井都装好了，将板放在37摄氏度的非二氧化碳培养箱中。

一小时后，在无菌环境中从板中吸出细胞粘合液，用 400 微升 37 摄氏度无菌水洗两次每井。然后让水井风干30至40分钟，然后覆盖板，在4摄氏度下过夜储存。要使传感器墨盒水合，在无菌环境中打开传感器墨盒包并取出内装物。

将传感器盒倒置放在公用电源板旁边，用 200 微升无菌水填充公用设施板的每个井。装进所有油井后，将传感器盒放入公用板，并连夜将组装的传感器盒和公用电源板放入 37 摄氏度的非二氧化碳培养箱中。在检测当天，拆下传感器墨盒盖，然后从公用用板的井中抽取水。

在每个井中加入 200 毫升预预热校准剂，并更换传感器墨盒盖。然后将传感器盒放回培养箱中约一小时。要准备小岛转移，手工挑选小岛到60乘15毫米的细胞培养盘，含有组装的介质，接近100%纯度。

收集所有小岛后，将准备好的球形微孔板的每个孔与 175 微升组装介质进行加载，并使用 P20 移液器设置为 15 微升，从细胞培养皿中吸入 15 个微升介质中的 15 个小孔。将小孔播种到球状微孔板上，将移液器尖端降至井底，几乎不抬起尖端，然后缓慢分配约五微升介质。要将小岛装入井中，请让小岛在移液器尖端中沉淀，然后以小体积的介质轻轻释放它们，直接释放在井中心底部的上方。

确认所有小岛都离开了移液器尖端，偶尔在显微镜下检查球形微孔板，以验证小岛是否播种在板的底部，而不是卡在井的两侧。当所有小岛都转移后，将微孔板放在37摄氏度的非二氧化碳培养箱中。在开始检测程序之前，将传感器盒的端口 A 加载 20 微升新鲜准备的 45 微摩尔寡霉素，B 端口装载 22 微升新鲜准备的 10 微摩尔 FCCP，以及 C 端口，装 25 微升新鲜准备的 25 微摩尔黄酮 AA。接下来，对细胞外通量分析仪进行30分钟基线呼吸期、42分钟寡霉素测量周期、30分钟FCCP期和30分钟环心气的AA周期。

然后按照屏幕上的指令运行检测，以校准传感器并插入微孔板。对于小岛输送到测定板，15个小岛应吸入15微升的介质，如图所示。该技术将导致每个微孔板底部中心一致放置小孔，从而进行精确的耗氧测量。

在这个代表性的实验中，显示单个油井的耗氧量不足，导致基准耗氧量非常低，对FCCP几乎没有反应。在这个实验中，大多数油井表现出显著的基线呼吸和药物反应。然而，两口井对罗泰诺没有反应，这表明药物没有正确释放到井中。

这些油井被排除在进一步分析之外。在这里，可以观察到一个成功的测定结果，其中井被正确装载了小孔，并正确地注射了药物。在进行检测前一天准备试剂和板，使小岛在分离或接受后不久使用是有益的。

在测定后，小岛可以恢复蛋白质或DNA提取，使耗氧数据正常化或量化线粒体DNA含量。在少数原灵长类动物小岛中测量线粒体功能的能力允许在单个生物复制中测试多种药物和其他操作。与原灵长类动物小岛一起工作的个人应该确保接受这些组织正确和安全处理的训练。

特别是使用适当的个人防护装备和适当处置这些样品。