باستخدام المجهر داخل واهية، وهذا البروتوكول تمكن من تصور في الوقت الحقيقي من الأنسجة المعوية تصل إلى قرار خلية واحدة ودراسة العمليات ديناميكية للغاية مثل سفك الخلايا. في تركيبة مع التجارب التتبع القياسية، يسمح هذا البروتوكول بتحديد كل من الاضطرابات نفاذية الأمعاء في الجسم الحي والتمييز بين البارا ونفاذية عبر الخلية. ويمكن استخدام هذا البروتوكول كأساس لوضع نهج إضافية للمجهر داخل الرحم لتصور عمليات أخرى ذات طابع خلوي شديد الحيوية من المصالح داخل الأنسجة المختلفة.
إن العرض المرئي لهذه الطريقة ضروري لفهم خطوات الإعداد الجراحي ووضع الحيوان الحي بطريقة تسهل الحصول على الصورة على سطح المخاط المعوي. قبل البدء في الإجراء، قم بتشغيل مربع القاعدة والماسح الضوئي لمجهر المسح الضوئي بالليزر confocal واضغط على بدء تشغيل الكمبيوتر. قم بتشغيل برنامج الحصول على الصور وحدد التكوين المناسب.
لتعيين دقة الصورة المناسبة، حدد التكوين والأجهزة والدقة وعمق البت و12. ضمن قائمة الاستحواذ، حدد XYZT لوضع الحصول على الصور وحدد الهدف إلى 20 أو 40X. لإعداد إعداد الاكتساب التسلسلي، انقر فوق البحث وإضافة وتحديد بين الإطارات.
لتكوين تسلسل واحد، قم بتشغيل مربع الليزر المرئي. تعيين أنبوب الmultiplier الضوئي واحد على وتحديد الطول الموجي للانبعاثات. لتكوين التسلسل الثاني، قم بتشغيل مربع الليزر المرئي.
تعيين أنبوب الmultiplier الضوئي اثنين على وتحديد الطول الموجي للانبعاثات. ثم قم بتنشيط أشعة الليزر المناسبة. بعد التأكد من عدم الاستجابة لقرصة إصبع القارص، استخدم براعم القطن لتطبيق مرهم على عيون الماوس المُغَدَّد، ثم قم بعمل شق سنتيمتر واحد في منطقة البطين الأيسر من البطن.
استخدام ملقط لإضفاء مظهر من ثلاثة إلى خمسة سنتيمتر قطعة من الأمعاء. جعل اثنين من شقوق صغيرة في الجزء العلوي والسفلي من الجزء الأمعاء وإدخال micropipette الزجاج في تجويف الأمعاء. ثم استخدام الكهربائية لفتح الجزء الخارجي الأمعاء طوليا على طول الجانب المضادة للميناتيكي وفضح الغشاء المخاطي.
شطف الأنسجة لفترة وجيزة مع محلول ملحي لإزالة محتوى البراز. لتلطيخ سطح الغشاء المخاطي المعوي، تطبيق 100 ميكرولترات من مليغرام واحد لكل ملليلتر من محلول acriflavine في قطرات على سطح المخاطية المكشوفة والسماح لللطخة لتطوير لمدة ثلاث دقائق قبل غسل الحل المتبقي مع برنامج تلفزيوني. المقبل, تطبيق 100 ميكروليترات من اثنين مليغرام لكل ملليلتر رودامين ديكستران حل في قطرات إلى الغشاء المخاطي لمدة ثلاث دقائق الحضانة قبل الغسيل مع برنامج تلفزيوني.
ثم ضع الماوس المُغفَّر على شريحة غلاف مثبتة على الغرفة المشطفة بـ 37 درجة مئوية من المالحة ، وقم بتعديل الموقف إذا لزم الأمر ، ووضع الإعداد على مرحلة المجهر المقلوب. مباشرة بعد وضع الماوس على المسرح، بدوره على مصدر الضوء وضبط موقف س ص حتى محور الإضاءة يركز على إعداد الأنسجة. من أجل تحديد حقل الرؤية، حدد مكعب التصفية المناسب.
افتح الغالق واستخدم عجلات الماكرو والصغرى للتركيز على سطح الغشاء المخاطي المعوي. ضبط موقف س ص لتحديد موقع منطقة حيث يمكن تصور عدة زغب داخل مجال الرؤية وتغيير مكعب مرشح للتحقق من أن تلطيخ دكستران رودامين هو أيضا مرئية في هذا المجال. عندما تم تحديد منطقة ذات أهمية، ابدأ عملية الحصول على الصورة وحدد التسلسل الأول لضبط قوة الليزر، والمكاسب، والتواؤم للتسلسل الأول.
ثم حدد التسلسل الثاني وضبط قوة الليزر ، وكسب ، وإزاحة للتسلسل الثاني. لتعريف نطاق Z-مكدس، افتح القائمة المنسدلة Z-مكدس. استخدام التحكم في الوصول إلى Z للتركيز على سطح الغشاء المخاطي وانقر فوق ابدأ.
التركيز على الحد السفلي من حيث إشارة لا يزال يمكن الكشف عنها وانقر فوق نهاية. حدد أرقام مكدسات Z، وتجنب هفوات الوقت أطول من دقيقتين لنقاط الوقت المتتاليتين، وافتح القائمة الزمنية لتحديد تصغير واقتناء حتى التوقف. لتحديد متوسط البند، حدد البحث عن واحد، متوسط البند الثاني، البحث عن اثنين، ومتوسط البند الثاني.
ثم للحصول على الصور، تعيين تنسيق إلى 1024 × 1024 بكسل والسرعة إلى 400 وانقر فوق ابدأ. GGTase ظهارية الظهارية THTASE فئران مشروطة ناقصة وضعت أمراض الأمعاء الحاد كما يتضح من زيادة في درجة الضرر النسيجي للأمعاء الدقيقة وزيادة نفاذية الظهارية المعوية يمكن أيضا الكشف عن طريق التتبع في التجارب في vivo باستخدام إدارة شفويا FITC-dextran. ويمكن تحديد أحداث سفك الخلية كخليات تتحرك من أحادية الظهارة إلى التجويف، مما يؤدي إلى ثغرات مؤقتة في سقف الظهارة التي يتم إغلاقها في النهاية عن طريق الاتصال بين الخلايا المجاورة، وهو ما يسمى تأثير السوستة.
ويلاحظ أن هذه الثغرات في كل من فئران التحكم ونقص GGTase ، على الرغم من أن تواتر هذه الظاهرة أعلى في هذه الأخيرة. ومن المثير للاهتمام, خلايا أخرى تظهر أيضا إلى امتصاص dextran. هذه ما يسمى أحداث الخلايا نفاذية تحدث أيضا أساسا في الفئران خروج المغلوب المشروطة.
ويمكن إجراء الالتصاق المناعي للبروتينات المتصلة بالهياكل السيّدة والمضيقة ذات الأهمية لتحديد أهداف محددة تسهم في حدوث اضطرابات نفاذية ظهارية محتملة تتحدد عن طريق المجهر الداخلي. يمكن استخدام هذه الطريقة لتحليل الظواهر الأخرى على سطح الغشاء المخاطي المعوي ، مثل التسرب البطانية أو الاتصال الظهاري المناعي في سياق العدوى المعوية.
