Utilizando microscopia intravital, este protocolo permite a visualização em tempo real do tecido intestinal até uma resolução unicelular e o estudo de processos altamente dinâmicos, como o derramamento de células. Em combinação com os experimentos de rastreador padrão, este protocolo permite a identificação de ambos os distúrbios de permeabilidade intestinal in vivo e a distinção entre permeabilidade para e transcelular. Este protocolo poderia ser usado como base para o desenvolvimento de abordagens adicionais de microscopia intravital para visualizar outros processos celulares altamente dinâmicos de interesses dentro de vários tecidos.
A demonstração visual desse método é essencial para compreender as etapas de preparação cirúrgica e posicionar o animal vivo de forma a facilitar a aquisição de imagens na superfície mucosa intestinal. Antes de iniciar o procedimento, ligue a caixa base e o scanner de um microscópio de varredura a laser confocal e pressione comece a ligar o computador. Inicie o software de aquisição de imagens e selecione a configuração apropriada.
Para definir a resolução de imagem apropriada, selecione configuração, hardware, resolução, profundidade de bits e 12. No menu de aquisição, selecione XYZT para o modo de aquisição de imagens e defina o objetivo para 20 ou 40X. Para configurar a configuração de aquisição sequencial, clique em procurar e adicionar e selecionar entre quadros.
Para configurar a sequência um, ligue a caixa de laser visível. Coloque o tubo fotomultiplier um para cima e defina o comprimento de onda de emissão. Para configurar a sequência dois, ligue a caixa de laser visível.
Ajuste o tubo fotomultiplier dois para cima e defina o comprimento de onda de emissão. Em seguida, ative os lasers apropriados. Após confirmar a falta de resposta ao dedo do pé, use um broto de algodão para aplicar pomada aos olhos do rato anestesiado e fazer uma incisão de um centímetro na região do ventrículo esquerdo do abdômen.
Use fórceps para exteriorizar um segmento de três a cinco centímetros do intestino. Faça duas pequenas incisões na parte superior e inferior do segmento intestinal e introduza uma micropipette de vidro no lúmen intestinal. Em seguida, use a eletrocauterização para abrir o segmento intestinal exteriorizado longitudinalmente ao longo do lado anti-mesentérico e expor a mucosa.
Enxágüe o tecido brevemente com solução salina para remover o conteúdo fecal. Para coloração da superfície da mucosa intestinal, aplique 100 microliters de um miligrama por mililitro de solução acriflavina em gotículas na superfície mucosa exposta e permita que a mancha se desenvolva por três minutos antes de lavar a solução restante com PBS. Em seguida, aplique 100 microliters de uma solução de dextran de rhodamina dextran de dois mililitros em gotículas na mucosa para incubação de três minutos antes de lavar com PBS.
Em seguida, coloque o supino do rato anestesiado em um slide de cobertura montado na câmara enxaguada com 37 graus Celsius salino, ajustando a posição, se necessário, e coloque a preparação no estágio do microscópio invertido. Imediatamente após colocar o mouse no palco, ligue a fonte de luz e ajuste a posição XY até que o eixo de iluminação esteja focado na preparação do tecido. Para selecionar o campo de visão, selecione o cubo de filtro apropriado.
Abra o obturador e use as macro e micro rodas para se concentrar na superfície da mucosa intestinal. Ajuste a posição XY para localizar uma área na qual vários villi podem ser visualizados dentro do campo de visão e alterar o cubo do filtro para verificar se a coloração do dextran de rhodamina também é visível nessa área. Quando uma área de interesse for identificada, inicie a aquisição da imagem e selecione a sequência uma para ajustar a potência do laser, ganho e deslocamento para a sequência um.
Em seguida, selecione a sequência dois e ajuste a potência do laser, ganhe e compense para a sequência dois. Para definir a faixa de pilha Z, abra o menu de entrega da pilha Z. Use o controle de acesso Z para se concentrar na superfície da mucosa e clique em começar.
Concentre-se no limite inferior de onde o sinal ainda é detectável e clique no final. Defina os números de pilhas Z, evitando lapsos de tempo por mais de dois minutos por dois pontos de tempo consecutivos e abra o menu de tempo para selecionar minimizar e adquirir até parar. Para definir a média da linha, selecione procurar um, linha média dois, buscar dois e linha média dois.
Em seguida, para adquirir imagens, defina o formato para 1024 x 1024 pixels e a velocidade para 400 e clique em iniciar. Camundongos condicionais deficientes epiteliais específicos das células epiteliais desenvolveram patologia intestinal grave, como demonstrado pelo aumento do escore de dano histológico do intestino delgado e aumento da permeabilidade epitelial intestinal também pode ser detectado através de rastreador em experimentos in vivo usando FITC-dextran administrado oralmente. Eventos de derramamento de células poderiam ser identificados como células que saem da monocamada epitelial para o lúmen, levando a lacunas temporárias no teto do epitélio que são finalmente fechadas pelo contato entre as células vizinhas, um chamado efeito zíper.
Essas lacunas são observadas tanto no controle quanto em camundongos deficientes GGTase, embora a frequência desse fenômeno seja maior neste último. Curiosamente, outras células também parecem captar o Dextran. Esses chamados eventos celulares permeáveis também ocorrem principalmente em camundongos eliminatórios condicional.
A imunossuagem de proteínas de interesse relacionadas ao citoesqueleto e a junção apertada pode ser realizada para identificar alvos específicos que contribuem para possíveis interrupções epiteliais de permeabilidade determinadas através de microscopia intravital. Este método pode ser utilizado para a análise de outros fenômenos na superfície da mucosa intestinal, como vazamento endotelial ou comunicação epitelial imune no contexto da infecção intestinal.
