このプロトコルは、生体内顕微鏡を用いて、腸組織を単一細胞分解能までリアルタイムに可視化し、細胞脱落などの非常に動的なプロセスの研究を可能にします。標準的なトレーサー実験と組み合わせて、このプロトコルは、生体内の腸透過性障害とパラおよびトランス細胞透過性の区別の両方の同定を可能にする。このプロトコルは、様々な組織内の関心のある他の非常に動的な細胞プロセスを視覚化するための追加のインビタルな顕微鏡法の開発の基礎として使用することができる。
この方法の視覚的なデモンストレーションは、外科的準備ステップを理解し、腸粘膜表面上の画像取得を容易にする方法で生きている動物を配置するために不可欠である。手順を開始する前に、共焦点レーザー顕微鏡のベースとスキャナボックスをオンにし、コンピュータの電源を入れるには、スタートを押します。イメージ取得ソフトウェアを起動し、適切な構成を選択します。
適切なイメージ解像度を設定するには、構成、ハードウェア、解像度、ビット深度、および 12 を選択します。取得メニューで、画像取得モードとして [XYZT] を選択し、目的を 20 または 40X に設定します。シーク集録設定を設定するには、[シーク] をクリックして、フレーム間で追加および選択します。
シーケンス 1 を構成するには、可視のレーザー ボックスをオンにします。フォトマルチプライヤチューブを1個に設定し、発光波長を定義します。シーケンス 2 を構成するには、可視レーザー ボックスをオンにします。
フォトマルチプライヤチューブを2本オンに設定し、発光波長を定義します。次に、適切なレーザーをアクティブにします。足の指のピンチに対する応答の欠如を確認した後、綿棒を使用して麻酔をかけ、腹部の左心室領域に1センチメートルの切開を行います。
鉗子を使用して、腸の3〜5センチメートルのセグメントを外装します。腸管の上部と下部に2つの小さな切開を行い、腸管腔にガラスマイクロピペットを導入します。次に電気カエタライゼーションを使用して、抗腸間膜側に沿って縦方向に外形化された腸管セグメントを開き、粘膜を露出させます。
食前液でティッシュを短時間すすいで、便の内容を取り除きます。腸粘膜表面の染色のために、1ミリリットルのアクリフラビン溶液を1ミリリットルの1ミリリットルの液滴を露出した粘膜表面に塗布し、残りの溶液をPBSで洗い流す前に3分間染色を可能にする。次に、PBSで洗浄する前に、3分間のインキュベーションのために、液滴中の1ミリリットルローダミンデキストラン溶液あたり2ミリグラムの100マイクロリットルを粘膜に塗布する。
次に、麻酔したマウスの上に、37°Cの生理食音をすすいでチャンバーに取り付けたカバースライドに置き、必要に応じて位置を調整し、逆顕微鏡ステージに準備を置きます。マウスをステージに置いた直後に、光源をオンにして、照明軸が組織の準備に焦点を合わせるまでXY位置を調整します。視野を選択するには、適切なフィルタ キューブを選択します。
シャッターを開け、マクロとマイクロホイールを使用して腸粘膜の表面に焦点を当てます。XY 位置を調整して、ビューのフィールド内で複数の絨毛を視覚化できる領域を見つけ、フィルターキューブを変更して、ローダミンデキストラン染色がその領域にも見えることを確認します。対象領域が特定されたら、画像取得を開始し、シーケンス 1 を選択して、シーケンス 1 のレーザーパワー、ゲイン、オフセットを調整します。
次に、シーケンス2を選択し、シーケンス2のレーザーパワー、ゲイン、オフセットを調整します。Z スタックの範囲を定義するには、Z スタックのドロップオフ メニューを開きます。Z-access コントロールを使用して粘膜の表面に焦点を合わせ、[開始]をクリックします。
信号がまだ検出可能な場所の下限に焦点を当てて、終了をクリックします。2 つの連続したタイム ポイントの 2 分より長いタイムラプスを避ける Z スタックの数を定義し、時間メニューを開いて最小化を選択し、停止するまで取得します。行平均を定義するには、シーク 1、行平均 2、シーク 2、および行平均 2 を選択します。
次に、画像を取得するには、フォーマットを1024 x 1024ピクセルに設定し、速度を400に設定して[開始]をクリックします。腸上皮細胞特異的GGTase欠損条件マウスは、小腸の組織学的損傷スコアの増加および腸上皮透過性の増加によって示されるように重度の腸病理を発症し、経口投与FITC-dextranを用いたインビボ実験においてトレーサーを介して検出することもできる。細胞脱落事象は、上皮単層から内腔に移動する細胞として同定することができ、上皮の天井の一時的なギャップを引き起こし、最終的に隣接する細胞間の接触によって閉じられる、いわゆるジッパー効果である。
これらのギャップは、コントロールマウスとGGTase欠損マウスの両方で観察されるが、後者ではこれらの現象の頻度が高い。興味深いことに、他の細胞もデキストランを取るように見えます。これらのいわゆる透過性細胞事象は、主に条件付きノックアウトマウスでも発生する。
目的の細胞骨格関連およびタイトな接合タンパク質の免疫染色を行い、生体内顕微鏡検査によって決定される潜在的な上皮透過性破壊に寄与する特定の標的を同定することができる。この方法は、腸内皮漏れや腸内感染の文脈における免疫上皮通信などの腸粘膜の表面上の他の現象の分析に使用することができる。
