Mediante microscopía intravital, este protocolo permite la visualización en tiempo real del tejido intestinal hasta una resolución de una sola célula y el estudio de procesos altamente dinámicos como el desprendimiento celular. En combinación con los experimentos de trazador estándar, este protocolo permite la identificación tanto de las perturbaciones de permeabilidad intestinal in vivo como de la distinción entre permeabilidad para y transcelular. Este protocolo podría utilizarse como base para el desarrollo de enfoques adicionales de microscopía intravital para visualizar otros procesos celulares altamente dinámicos de intereses dentro de diversos tejidos.
La demostración visual de este método es esencial para entender los pasos de preparación quirúrgica y posicionar al animal vivo de una manera que facilite la adquisición de imágenes en la superficie de la mucosa intestinal. Antes de comenzar el procedimiento, encienda la base y la caja del escáner de un microscopio de escaneo láser confocal y pulse Start para encender el ordenador. Inicie el software de adquisición de imágenes y seleccione la configuración adecuada.
Para establecer la resolución de imagen adecuada, seleccione la configuración, el hardware, la resolución, la profundidad de bits y 12. En el menú de adquisición, seleccione XYZT para el modo de adquisición de imágenes y establezca el objetivo en 20 o 40X. Para configurar la configuración de adquisición secuencial, haga clic en Buscar y agregar y seleccionar entre fotogramas.
Para configurar la secuencia uno, active el cuadro láser visible. Ajuste el tubo fotomultiplicador uno a activado y defina la longitud de onda de emisión. Para configurar la secuencia dos, active el cuadro láser visible.
Ajuste el tubo fotomultiplicador dos en encendido y defina la longitud de onda de emisión. A continuación, active los láseres apropiados. Después de confirmar la falta de respuesta al pellizco del dedo del otro, usa un bastoncillo de algodón para aplicar un ungido en los ojos del ratón anestesiado y haz una incisión de un centímetro en la región del ventrículo izquierdo del abdomen.
Use fórceps para exteriorizar un segmento de tres a cinco centímetros del intestino. Haga dos pequeñas incisiones en la parte superior e inferior del segmento intestinal e introduzca una micropipeta de vidrio en el lumen intestinal. Luego utilice la electrocauterización para abrir el segmento intestinal exteriorizado longitudinalmente a lo largo del lado antimesentérico y exponer la mucosa.
Enjuague brevemente el tejido con solución salina para eliminar el contenido fecal. Para la tinción de la superficie de la mucosa intestinal, aplicar 100 microlitros de un miligramo por mililitro de solución de acriflavina en gotas sobre la superficie de la mucosa expuesta y permitir que la mancha se desarrolle durante tres minutos antes de lavar la solución restante con PBS. A continuación, aplicar 100 microlitros de una solución de dextrano de rhodamina de dos miligramos por mililitro en gotas a la mucosa para una incubación de tres minutos antes de lavar con PBS.
A continuación, coloque el ratón anestesiado supino en una corredera de cubierta montada en la cámara enjuagado con 37 grados Celsius salina, ajustando la posición si es necesario, y coloque la preparación en la etapa del microscopio invertido. Inmediatamente después de colocar el ratón en el escenario, encienda la fuente de luz y ajuste la posición XY hasta que el eje de iluminación se centre en la preparación del tejido. Para seleccionar el campo de visión, seleccione el cubo de filtro apropiado.
Abra el obturador y utilice las ruedas macro y micro para centrarse en la superficie de la mucosa intestinal. Ajuste la posición XY para localizar un área en la que se puedan visualizar varias vellosidades dentro del campo de visión y cambie el cubo del filtro para verificar que la tinción de dextrano de rhodamine también sea visible en esa área. Cuando se haya identificado un área de interés, inicie la adquisición de la imagen y seleccione la secuencia uno para ajustar la potencia, ganancia y desplazamiento del láser para la secuencia uno.
A continuación, seleccione la secuencia dos y ajuste la potencia, ganancia y desplazamiento del láser para la secuencia dos. Para definir el rango de la pila Z, abra el menú desplegable de la pila Z. Utilice el control de acceso Z para centrarse en la superficie de la mucosa y haga clic en comenzar.
Concéntrese en el límite inferior de donde la señal todavía es detectable y haga clic en end. Defina los números de pilas Z, evitando lapsos de tiempo de más de dos minutos durante dos puntos de tiempo consecutivos y abra el menú de tiempo para seleccionar minimizar y adquirir hasta detenerse. Para definir el promedio de línea, seleccione buscar uno, el promedio de línea dos, busque dos y el promedio de línea dos.
A continuación, para adquirir imágenes, establezca el formato en 1024 x 1024 píxeles y la velocidad en 400 y haga clic en Iniciar. Los ratones condicionales con deficiencia de células epiteliales intestinales y los ratones condicionales deficientes de células epiteliales desarrollaron patología intestinal grave como lo demuestra un aumento en la puntuación de daño histológico del intestino delgado y el aumento de la permeabilidad epitelial intestinal también se puede detectar a través del trazador en experimentos in vivo utilizando FITC-dextran administrado por vía oral. Los eventos de desprendimiento celular podrían ser identificados como células que se mueven fuera de la monocapa epitelial en el lumen, lo que conduce a huecos temporales en el techo del epitelio que finalmente se cierran por el contacto entre las células vecinas, un llamado efecto de cremallera.
Estas brechas se observan tanto en ratones con control como en ratones con deficiencia de GGTase, aunque la frecuencia de estos fenómenos es mayor en este último. Curiosamente, otras células también parecen captar dextrán. Estos llamados eventos celulares permeables también ocurren principalmente en ratones nocaut condicionales.
La inmunostaining de proteínas de unión estrecha y relacionadas con citoesqueletos se puede realizar para identificar objetivos específicos que contribuyen a posibles alteraciones de la permeabilidad epitelial determinadas a través de la microscopía intravital. Este método se puede utilizar para el análisis de otros fenómenos en la superficie de la mucosa intestinal, como la fuga endotelial o la comunicación epitelial inmune en el contexto de la infección intestinal.
