İntravital mikroskopi kullanılarak, bu protokol tek hücreçözünürlüğe kadar bağırsak dokusunun gerçek zamanlı görselleştirilmesive hücre dökülmesi gibi son derece dinamik süreçlerin incelenmesini sağlar. Standart izleyici deneyleri ile birlikte, bu protokol hem in vivo intestinal geçirgenlik bozukluklarının tanımlanmasına hem de para ve hücre sellüler geçirgenlik arasındaki ayrımın belirlenmesine izin verir. Bu protokol, çeşitli dokular içinde ilgi alanlarının diğer son derece dinamik hücresel süreçlerini görselleştirmek için ek intravital mikroskopi yaklaşımlarının geliştirilmesinde temel olarak kullanılabilir.
Bu yöntemin görsel gösterimi cerrahi hazırlık adımlarını anlamak ve canlı hayvanı bağırsak mukozal yüzeyinde görüntü edinimi kolaylaştıracak şekilde konumlandırmak için gereklidir. İşleme başlamadan önce, confocal lazer tarama mikroskobunun tabanını ve tarayıcı kutusunu açın ve bilgisayarı açmak için basmaya başlayın. Görüntü edinme yazılımını başlatın ve uygun yapılandırmayı seçin.
Uygun görüntü çözünürlüğünü ayarlamak için yapılandırma, donanım, çözünürlük, bit derinliği ve 12'yi seçin. Edinme menüsü altında, görüntü edinme modu için XYZT'yi seçin ve hedefi 20 veya 40X olarak ayarlayın. Sıralı edinme ayarını ayarlamak için, ara ve ekle ve çerçeveler arasında seçim yapmak için tıklatın.
Birinci sırayı yapılandırmak için görünür lazer kutusunu açın. Fotoçarpan tüpünü bire ayarlayın ve emisyon dalga boyunu tanımlayın. İkinci sırayı yapılandırmak için görünür lazer kutusunu açın.
Fotoçarpan tüpünü iki üzerine ayarlayın ve emisyon dalga boyunu tanımlayın. Sonra uygun lazerler etkinleştirin. Parmak tutam yanıt eksikliği doğruladıktan sonra, anestezili fare gözlerine merhem uygulamak ve karın sol ventrikül bölgesinde bir santimetre lik kesi yapmak için bir pamuk tomurcuk kullanın.
Bağırsağın 3-5 santimetrelik bir bölümünü dışlaştırmak için çalgılar kullanın. Bağırsak segmentinin üst ve alt kısmında iki küçük kesiler olun ve bağırsak lümen içine bir cam mikropipet tanıtmak. Daha sonra anti-mezenterik tarafı boyunca dışlanmış bağırsak segmentini uzunlamasına açmak ve mukozaortaya çıkarmak için elektrokoterizasyon kullanın.
Dışkı içeriğini çıkarmak için tuzlu çözelti ile kısa bir süre doku durulayın. Bağırsak mukoza yüzeyinin boyanması için, damlacıklara mililitre başına bir miligram lık bir miligram 100 mikrolitre acriflavine çözeltisi damlacıkları maruz kalan mukozal yüzeye uygulayın ve kalan çözeltiyi PBS ile yıkamadan önce lekenin üç dakika boyunca gelişmesine izin verin. Daha sonra, PBS ile yıkamadan önce üç dakika kuluçka için mukoza ya da damlacıklar için mililitre rhodamine dextran çözeltisi başına iki miligram 100 mikrolitre uygulayın.
Daha sonra anestezili fare supine 37 derece santigrat tuzlu ile durulanmış oda üzerine monte edilmiş bir kapak slayt yerleştirin, gerekirse konumunu ayarlayarak, ve ters mikroskop aşamasına hazırlık yerleştirin. Fareyi sahneye yerleştirdikten hemen sonra, ışık kaynağını açın ve aydınlatma ekseni doku hazırlığına odaklanana kadar XY konumunu ayarlayın. Görme alanını seçmek için uygun filtre küpünü seçin.
Deklanşörü açın ve bağırsak mukozayüzeyine odaklanmak için makro ve mikro tekerlekleri kullanın. XY konumunu, görüş alanı içinde birkaç villinin görüntülenebildiği bir alanı bulmak için ayarlayın ve o bölgede rhodamine dextran boyamanın da görülebildiğinden doğrulamak için filtre küpünü değiştirin. İlgi çekici bir alan belirlendiğinde, görüntü edinimini başlatın ve lazer gücünü ayarlamak için birinci sırayı seçin, birinci sekans için kazanç ve mahsup.
Ardından ikinci sırayı seçin ve lazer gücünü, kazancını ve ikinci sırayı ofset olarak ayarlayın. Z yığını aralığını tanımlamak için Z yığını bırakma menüsünü açın. Mukozanın yüzeyine odaklanmak için Z-access denetimini kullanın ve başlat'ı tıklatın.
Sinyalin hala algılabildiği alt sınıra odaklanın ve bitişe tıklayın. Art arda iki zaman noktası için iki dakikadan uzun zaman atlamalarından kaçınarak Z-yığınlarının sayısını tanımlayın ve en aza indirgenip duruncaya kadar elde etmek için zaman menüsünü açın. Satır ortalamasını tanımlamak için bir, satır ortalaması iki, iki ve satır ortalaması iki'yi arayın'ı seçin.
Ardından görüntü elde etmek için formatı 1024 x 1024 piksele, hızı 400 piksele ayarlayın ve başlat'ı tıklatın. İnce bağırsağın histolojik hasar skorunda artış gösterildiği gibi bağırsak epitel hücrespesifik GGTase eksikliği olan koşullu farelerde ciddi bağırsak patolojisi gelişti ve bağırsak epitel geçirgenliği de ağızdan uygulanan FITC-dextran kullanılarak in-vivo deneylerde izleyici ile saptanabilir. Hücre dökülme olayları hücreler lümen içine epitel monolayer dışarı hareket olarak tespit edilebilir, sonunda komşu hücreler arasındaki temas tarafından kapatılır epitel tavanında geçici boşluklara yol açan, bir sözde fermuar etkisi.
Bu boşluklar hem kontrol hem de GGTase eksikliği olan farelerde gözlenir, ancak bu fenomenin sıklığı ikincisinde daha yüksektir. İlginçtir, diğer hücreler de dextran alımı görünür. Bu sözde geçirbilebilir hücre olayları da şartlı nakavt fareler de esas olarak meydana gelir.
İntravital mikroskopi ile belirlenen potansiyel epitelyal geçirgenlik bozulmalarına katkıda bulunan belirli hedefleri belirlemek için sitoiskeletle ilgili ve sıkı kavşak proteinlerinin immünboyama yapılabilir. Bu yöntem bağırsak mukozası yüzeyinde ki endotel kaçağı veya bağırsak enfeksiyonu bağlamında immün epitel iletişim gibi diğer fenomenlerin analizi için kullanılabilir.
