Mit hilfe der intravitalen Mikroskopie ermöglicht dieses Protokoll die Echtzeit-Visualisierung von Darmgewebe bis zu einer einzelzelligen Auflösung und die Untersuchung hochdynamischer Prozesse wie zellabwurf. In Kombination mit den Standard-Tracer-Experimenten ermöglicht dieses Protokoll die Identifizierung sowohl von Darmpermeabilitätsstörungen in vivo als auch der Unterscheidung zwischen para- und transzellulärer Permeabilität. Dieses Protokoll könnte als Grundlage für die Entwicklung zusätzlicher intravitaler Mikroskopieansätze zur Visualisierung anderer hochdynamischer zellulärer Interessenprozesse in verschiedenen Geweben dienen.
Die visuelle Demonstration dieser Methode ist wichtig, um die chirurgischen Präparationsschritte zu verstehen und das lebende Tier so zu positionieren, dass die Bildaufnahme auf der Darmschleimhautoberfläche erleichtert wird. Bevor Sie mit dem Vorgang beginnen, schalten Sie die Basis- und Scannerbox eines konfokalen Laserscanmikroskops ein und drücken Sie den Computer ein. Starten Sie die Bildaufnahmesoftware, und wählen Sie die entsprechende Konfiguration aus.
Um die entsprechende Bildauflösung festzulegen, wählen Sie Konfiguration, Hardware, Auflösung, Bittiefe und 12 aus. Wählen Sie im Aufnahmemenü XYZT für den Bildaufnahmemodus aus und setzen Sie das Ziel auf 20 oder 40X. Um die Einstellung für die sequenzielle Erfassung einzurichten, klicken Sie auf Suchen und Hinzufügen und Auswählen zwischen Frames.
Um Sequenz eins zu konfigurieren, schalten Sie die sichtbare Laserbox ein. Stellen Sie photomultiplier Tube eins auf und definieren Sie die Emissionswellenlänge. Um Sequenz zwei zu konfigurieren, schalten Sie die sichtbare Laserbox ein.
Stellen Sie photomultiplier Rohr zwei auf und definieren Sie die Emissionswellenlänge. Aktivieren Sie dann die entsprechenden Laser. Nach der Bestätigung eines Mangels an Reaktion auf Zehenkneifen, verwenden Sie eine Baumwollknospe, um Salbe auf die Augen der anästhesierten Maus aufzutragen und einen ein Zentimeter großen Schnitt im linken Ventrikelbereich des Bauches zu machen.
Verwenden Sie Zangen, um ein drei- bis fünf Zentimeter großes Segment des Darms zu exteriorisieren. Machen Sie zwei kleine Einschnitte an der Ober- und Unterseite des Darmsegments und führen Sie eine Glasmikropipette in das Darmlumen ein. Dann verwenden Sie die Elektrokauterisierung, um das exteriorisierte Darmsegment längs entlang der anti-mesenterischen Seite zu öffnen und die Schleimhaut freizulegen.
Spülen Sie das Gewebe kurz mit einer Salinelösung, um den Fäkaliengehalt zu entfernen. Zur Färbung der Darmschleimhautoberfläche 100 Mikroliter eines Milligramm pro Milliliter Acriflavine-Lösung in Tröpfchen auf die exponierte Schleimhautoberfläche auftragen und den Fleck drei Minuten lang entwickeln lassen, bevor er die restliche Lösung mit PBS auswaschen kann. Als nächstes 100 Mikroliter einer zwei Milligramm pro Milliliter Rhodamine-Dextran-Lösung in Tröpfchen auf die Schleimhaut für drei Minütige Inkubation vor dem Waschen mit PBS anwenden.
Dann legen Sie die anästhesierte Maus-Supine auf eine Abdeckungsrutsche, die auf der mit 37 Grad Celsius-Saline abspülten Kammer montiert ist, wobei die Position bei Bedarf angepasst wird, und legen Sie das Präparat auf die invertierte Mikroskopstufe. Unmittelbar nach dem Platzieren der Maus auf die Bühne, schalten Sie die Lichtquelle ein und passen Sie die XY-Position an, bis die Beleuchtungsachse auf das Gewebepräparat fokussiert ist. Um das Sichtfeld auszuwählen, wählen Sie den entsprechenden Filterwürfel aus.
Öffnen Sie den Verschluss und verwenden Sie die Makro- und Mikroräder, um sich auf die Oberfläche der Darmschleimhaut zu konzentrieren. Passen Sie die XY-Position an, um einen Bereich zu finden, in dem mehrere Zotten im Sichtfeld visualisiert werden können, und ändern Sie den Filterwürfel, um sicherzustellen, dass die Rhodamine dextran Färbung auch in diesem Bereich sichtbar ist. Wenn ein Interessenbereich identifiziert wurde, starten Sie die Bildaufnahme und wählen Sie Sequenz eins aus, um die Laserleistung, Verstärkung und Versatz für Sequenz 1 anzupassen.
Wählen Sie dann Sequenz zwei aus und passen Sie die Laserleistung, Verstärkung und Versatz für Sequenz zwei an. Um den Z-Stack-Bereich zu definieren, öffnen Sie das Drop-off-Menü Z-Stack. Verwenden Sie die Z-Access-Steuerung, um sich auf die Oberfläche der Schleimhaut zu konzentrieren, und klicken Sie auf start.
Konzentrieren Sie sich auf die untere Grenze, wo das Signal noch erkennbar ist, und klicken Sie auf Ende. Definieren Sie die Anzahl der Z-Stacks, vermeiden Sie Zeitraffer länger als zwei Minuten für zwei aufeinander folgende Zeitpunkte, und öffnen Sie das Zeitmenü, um minimieren und erfassen sie bis zum Anhalten auszuwählen. Um den Zeilendurchschnitt zu definieren, wählen Sie Suchen eins, Liniendurchschnitt zwei, Suchen zwei und Liniendurchschnitt zwei aus.
Um Bilder zu erfassen, stellen Sie das Format auf 1024 x 1024 Pixel und die Geschwindigkeit auf 400 ein und klicken Sie auf Start. Intestinale Epithelzellspezifische GGTase-mangelhafte bedingte Mäuse entwickelten eine schwere Darmpathologie, wie eine Erhöhung des histologischen Schadensscores des Dünndarms und eine erhöhte Darmepithelperthelperabilität auch über Tracer in In-vivo-Experimenten mit oral verabreichtem FITC-Dextran nachgewiesen werden können. Zellabwurfereignisse konnten als Zellen identifiziert werden, die sich aus der epithelialen Monoschicht in das Lumen bewegen, was zu temporären Lücken in der Decke des Epithels führt, die schließlich durch den Kontakt zwischen benachbarten Zellen geschlossen werden, ein sogenannter Reißverschlusseffekt.
Diese Lücken werden sowohl bei Kontroll- als auch bei GGTase-Mäusen beobachtet, obwohl die Häufigkeit dieser Phänomene bei letzteren höher ist. Interessanterweise scheinen auch andere Zellen Dextran aufzunehmen. Diese sogenannten durchlässigen Zellereignisse treten auch hauptsächlich bei bedingten Knockout-Mäusen auf.
Die Immunostainierung von zytoskelettbedingten und engen Junction-Proteinen von Interesse kann durchgeführt werden, um spezifische Ziele zu identifizieren, die zu potenziellen Epithelpermbarkeitsstörungen beitragen, die durch intravitale Mikroskopie bestimmt werden. Diese Methode kann für die Analyse anderer Phänomene auf der Oberfläche der Darmschleimhaut verwendet werden, wie endotheliale Leckage oder Immunepithelkommunikation im Zusammenhang mit Darminfektionen.
