基于内显微镜的方法，用于评估肠道渗透性和上皮细胞脱落性能

使用病毒内显微镜，该协议使肠道组织能够实时可视化，高达单细胞分辨率，并研究高动态过程，如细胞脱落。结合标准示踪剂实验，该协议允许识别体内肠道渗透性干扰，并区分半细胞和跨细胞渗透性。该协议可以用作开发其他病毒内显微镜方法的基础，以可视化各种组织内感兴趣的其他高动态细胞过程。

这种方法的视觉演示对于了解手术准备步骤和定位活体动物，促进肠道粘膜表面的图像采集至关重要。在开始手术之前，打开共和激光扫描显微镜的底座和扫描仪盒，然后按开始打开计算机。启动图像采集软件并选择适当的配置。

要设置适当的图像分辨率，请选择配置、硬件、分辨率、位深度和 12。在采集菜单下，为图像采集模式选择 XYZT，将目标设置为 20 或 40 倍。要设置顺序采集设置，请单击"查找"并在帧之间添加和选择。

要配置序列 1，请打开可见的激光盒。将光电倍增管一设置为打开并定义发射波长。要配置序列 2，请打开可见的激光盒。

将光电倍增管二设置为打开并定义发射波长。然后激活适当的激光器。在确认对手趾捏没有反应后，使用棉芽对麻醉小鼠的眼睛涂抹软膏，并在腹部左心室区域进行一厘米切口。

使用钳子将肠道的三到五厘米段外化。在肠道部分的顶部和底部做两个小切口，并在肠道流明中引入玻璃微管。然后使用电烧打开外化肠道段纵向沿抗肠侧，并暴露粘膜。

用盐水溶液短暂冲洗组织，以去除粪便。对于肠道粘膜表面的染色，在液滴中涂抹 100 微升每毫升 1 毫克的阿克里弗拉文溶液，让污渍在用 PBS 洗涤剩余溶液之前发展三分钟。接下来，在用PBS清洗之前，将每毫升2毫克的罗达明葡萄糖溶液中的每毫升2毫克的100微升涂抹在粘膜中，进行三分钟的孵育。

然后将麻醉小鼠 supine 放在安装在用 37 摄氏度盐水冲洗的腔室的盖幻灯片上，必要时调整位置，然后将制备放在倒置显微镜阶段。将鼠标放置到舞台上后，立即打开光源并调整 XY 位置，直到照明轴聚焦在组织准备上。要选择视野，请选择相应的滤波数据集。

打开快门，使用微轮聚焦肠道粘膜的表面。调整 XY 位置以定位可在视野中可视化多个 villi 的区域，并更改滤波块以验证罗达明二维克兰染色在该区域中是否可见。确定感兴趣区域后，开始图像采集并选择序列 1 以调整序列 1 的激光功率、增益和偏移。

然后选择序列 2 并调整序列 2 的激光功率、增益和偏移。要定义 Z 堆栈范围，请打开 Z 堆栈放置菜单。使用 Z 访问控制聚焦粘膜表面，然后单击"开始"。

关注信号仍可检测到的底限，然后单击结束。定义 Z 堆栈的数量，避免连续两个时间点的延时超过两分钟，并打开时间菜单以选择最小化和获取直到停止。要定义线平均值，请选择查找 1，线平均值 2，查找 2，线平均值 2。

然后，要获取图像，请将格式设置为 1024 x 1024 像素，将速度设置为 400，然后单击"开始"。肠道上皮细胞特异性GGTase缺乏条件小鼠发展严重肠道病理学，小肠组织损伤评分增加，肠道上皮渗透性增加，也可以通过体内实验中的示踪剂使用口头施用的 FITC-dextran 来检测。细胞脱落事件可以识别为细胞从上皮单层进入流明，导致上皮天花板的暂时间隙，最终因相邻细胞之间的接触而闭合，即所谓的拉链效应。

这些差距在控制和GGTase缺陷小鼠中观察到，尽管这些现象的频率在后者中较高。有趣的是，其他细胞似乎也吸收了脱克兰。这些所谓的可渗透细胞事件也主要发生在有条件的敲除小鼠中。

可对细胞骨架相关和相关紧密结点蛋白进行免疫渗透，以确定有助于通过病毒内显微镜确定的潜在上皮渗透性中断的特定目标。该方法可用于分析肠道粘膜表面的其他现象，如内皮渗漏或肠道感染情况下的免疫上皮交流。