이 프로토콜은 인트라바이탈 현미경 검사를 사용하여 장 조직의 실시간 시각화를 단일 세포 해상도까지 시각화하고 세포 흘리기와 같은 매우 역동적인 공정에 대한 연구를 가능하게 합니다. 표준 추적기 실험과 함께, 이 프로토콜은 생체 내장 투과성 장애와 파라 및 세포간 투과성 사이의 구별을 모두 식별할 수 있게 합니다. 이 프로토콜은 다양한 조직 내에서 관심의 다른 매우 역동적 인 세포 프로세스를 시각화하기위한 추가 내 중요한 현미경 접근법의 개발을위한 기초로 사용할 수 있습니다.
이 방법의 시각적 데모는 수술 준비 단계를 이해하고 살아있는 동물을 장 점막 표면에 이미지 수집을 용이하게하는 방식으로 배치하는 데 필수적입니다. 절차를 시작하기 전에 공초점 레이저 스캐닝 현미경의 베이스 및 스캐너 상자를 켜고 컴퓨터를 켜기 시작합니다. 이미지 수집 소프트웨어를 실행하고 적절한 구성을 선택합니다.
적절한 이미지 해상도를 설정하려면 구성, 하드웨어, 해상도, 비트 깊이 및 12를 선택합니다. 수집 메뉴에서 이미지 수집 모드의 XYZT를 선택하고 목표를 20배 또는 40배로 설정합니다. 순차적 획득 설정을 설정하려면 프레임 간 찾아서 추가 및 선택합니다.
시퀀스를 구성하려면 보이는 레이저 상자를 켭니다. 광증 튜브를 일대일로 설정하고 방출 파장을 정의합니다. 시퀀스 2를 구성하려면 보이는 레이저 상자를 켭니다.
광증 튜브를 2개에 설정하고 방출 파장을 정의합니다. 그런 다음 적절한 레이저를 활성화합니다. 발가락 핀치에 대한 반응의 부족을 확인 한 후, 마취 마우스의 눈에 연고를 적용하고 복부의 왼쪽 심실 영역에서 1 센티미터 절개를 만들기 위해 면 봉오리를 사용합니다.
집게를 사용하여 장의 3~5센티미터 세그먼트를 외부화합니다. 창자 세그먼트의 상단과 하단에 두 개의 작은 절개를 만들고 장 루멘에 유리 마이크로 피펫을 소개합니다. 그런 다음 전기 카우터화를 사용하여 항 막질 측을 따라 세로로 외부장 세그먼트를 열고 점막을 노출시합니다.
배설물 함량을 제거하기 위해 식염수 용액으로 조직을 간단히 헹이시다. 장 점막 표면의 염색을 위해, 노출된 점막 표면에 액적에 아크리플라빈 용액의 밀리리터 당 1밀리그램의 1밀리리터를 적용하고 PBS로 남은 용액을 씻어내기 전에 3분 동안 얼룩이 개발되도록 한다. 다음으로, PBS로 세척하기 전에 3 분 배양에 대한 점막에 밀리리터 로다민 dextran 용액 당 2 밀리그램의 100 마이크로 리터를 적용합니다.
그런 다음 마취 된 마우스 supine을 섭씨 37도식염수로 헹구고 필요한 경우 위치를 조정하고 반전 된 현미경 단계에 준비를 배치하여 챔버에 장착 된 커버 슬라이드에 놓습니다. 마우스를 무대에 올려놓은 직후, 광원을 켜고 조명축이 조직 제제에 초점을 맞출 때까지 XY 위치를 조정한다. 비전 필드를 선택하려면 적절한 필터 큐브를 선택합니다.
셔터를 열고 매크로와 마이크로 휠을 사용하여 장 점막표면에 초점을 맞춥니다. XY 위치를 조정하여 시야 내에서 여러 개의 빌리를 시각화할 수 있는 영역을 찾고 필터 큐브를 변경하여 로다민 염색도 해당 영역에 보이는지 확인합니다. 관심 영역이 확인되면 이미지 수집을 시작하고 시퀀스 하나를 선택하여 레이저 전력, 게인 및 시퀀스 1에 대한 오프셋을 조정합니다.
그런 다음 시퀀스 2를 선택하고 시퀀스 2에 대해 레이저 전력, 게인 및 오프셋을 조정합니다. Z 스택 범위를 정의하려면 Z 스택 드롭오프 메뉴를 엽니다. Z 액세스 컨트롤을 사용하여 점막 표면에 초점을 맞추고 시작을 클릭합니다.
신호가 여전히 감지 가능한 위치의 하단 제한에 초점을 맞추고 끝을 클릭합니다. Z 스택 수를 정의하고, 2분 이상 경과를 방지하고, 시간 메뉴를 열어 최소화하고 중지될 때까지 획득합니다. 선 평균을 정의하려면 1회, 줄 평균 2개, 2줄 평균 을 선택, 2줄 평균 2개를 선택합니다.
그런 다음 이미지를 얻으려면 형식을 1024 x 1024 픽셀로 설정하고 속도를 400으로 설정하고 시작을 클릭합니다. 장 상피 세포 특이적 GGTase 결핍 조건부 마우스는 소장의 조직학적 손상 점수의 증가와 증가된 장 상피 투과성의 증가에 의해 입증된 바와 같이 심한 장 병리를 개발했으며, 또한 경구 투여FITC-dextran을 사용하여 생체 내 의 추적자 내 의 추적자를 통해 검출될 수 있다. 세포 흘리기 이벤트는 상피 단층에서 루멘으로 이동하는 세포로 식별될 수 있으며, 이는 인접한 세포 사이의 접촉에 의해 마침내 닫혀있는 상피의 천장에 일시적인 간격으로 이어질 수 있습니다.
이러한 간격은 대조군과 GGTase 결핍 마우스 모두에서 관찰되지만, 이러한 현상의 빈도는 후자에서 더 높다. 흥미롭게도, 다른 세포는 또한 dextran을 uptake 나타납니다. 이러한 소위 투과성 세포 이벤트는 주로 조건부 녹아웃 마우스에서 발생합니다.
관심의 세포 골격 관련 및 단단한 접합 단백질의 면역 염색은 중요한 현미경 검사를 통해 결정된 잠재적인 상피 투과성 중단에 기여하는 특정 표적을 확인하기 위하여 능력을 발휘할 수 있습니다. 이 방법은 장 내피 누설 또는 장 감염의 맥락에서 면역 상피 통신과 같은 장 점막의 표면에 다른 현상의 분석에 사용될 수있다.
