Utilisant la microscopie intravitale, ce protocole permet la visualisation en temps réel du tissu intestinal jusqu’à une résolution à cellule unique et l’étude de processus très dynamiques tels que l’excrétion cellulaire. En combinaison avec les expériences de traçage standard, ce protocole permet l’identification des troubles de perméabilité intestinale in vivo et la distinction entre la perméabilité para et transcellulaire. Ce protocole pourrait servir de base au développement d’approches supplémentaires de microscopie intravitale pour visualiser d’autres processus cellulaires très dynamiques d’intérêts dans divers tissus.
La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle pour comprendre les étapes chirurgicales de préparation et pour positionner l’animal vivant d’une manière qui facilite l’acquisition d’image sur la surface muqueuse intestinale. Avant de commencer la procédure, allumez la base et la boîte de scanner d’un microscope à balayage laser confocal et appuyez sur commencer à allumer l’ordinateur. Lancez le logiciel d’acquisition d’images et sélectionnez la configuration appropriée.
Pour définir la résolution d’image appropriée, sélectionnez la configuration, le matériel, la résolution, la profondeur du bit et 12. Dans le menu d’acquisition, sélectionnez XYZT pour le mode d’acquisition d’image et fixez l’objectif à 20 ou 40X. Pour configurer le paramètre d’acquisition séquentiel, cliquez sur rechercher et ajouter et sélectionner entre les images.
Pour configurer la séquence 1, allumez la boîte laser visible. Réglez le tube photomultiplier un à l’autre et définissez la longueur d’onde d’émission. Pour configurer la séquence deux, allumez la boîte laser visible.
Réglez le tube photomultiplier deux à l’onde et définissez la longueur d’onde d’émission. Activez ensuite les lasers appropriés. Après avoir confirmé un manque de réponse au pincement des pieds, utilisez un bourgeon de coton pour appliquer de l’onguent sur les yeux de la souris anesthésiée et faire une incision d’un centimètre dans la région ventricule gauche de l’abdomen.
Utilisez des forceps pour extérioriser un segment de trois à cinq centimètres de l’intestin. Faire deux petites incisions en haut et en bas du segment intestinal et introduire une micropipette en verre dans le lumen intestinal. Ensuite, utilisez l’électrocauterisation pour ouvrir le segment intestinal extériorisé longitudinalment le long du côté anti-mésentérique et exposer la muqueuse.
Rincez brièvement le tissu avec une solution saline pour enlever la teneur fécale. Pour la coloration de la surface intestinale de la muqueuse, appliquer 100 microlitres d’un milligramme par millilitre de solution d’acriflavine en gouttelettes sur la surface muqueuse exposée et laisser la tache se développer pendant trois minutes avant de laver la solution restante avec PBS. Ensuite, appliquez 100 microlitres d’une solution de dextran rhodamine de deux millilitres par millilitre dans les gouttelettes à la muqueuse pendant trois minutes d’incubation avant de les laver avec du PBS.
Ensuite, placez la sulfpine anesthésiée de souris sur une glissière de couverture montée sur la chambre rincée avec 37 degrés Celsius salin, en ajustant la position si nécessaire, et placez la préparation sur le stade du microscope inversé. Immédiatement après avoir placé la souris sur la scène, allumez la source lumineuse et ajustez la position XY jusqu’à ce que l’axe d’éclairage soit concentré sur la préparation des tissus. Afin de sélectionner le champ de vision, sélectionnez le cube de filtre approprié.
Ouvrez l’obturateur et utilisez les macro et micro roues pour vous concentrer sur la surface de la muqueuse intestinale. Ajustez la position XY pour localiser une zone dans laquelle plusieurs villosités peuvent être visualisées dans le champ de vision et changez le cube de filtre pour vérifier que la coloration de dextran de rhodamine est également visible dans cette zone. Lorsqu’une zone d’intérêt a été identifiée, commencez l’acquisition de l’image et sélectionnez la séquence une pour ajuster la puissance laser, le gain et le décalage pour la première séquence.
Sélectionnez ensuite la séquence deux et ajustez la puissance laser, le gain et le décalage pour la séquence deux. Pour définir la plage Z-stack, ouvrez le menu de drop-off Z-stack. Utilisez le contrôle d’accès Z pour vous concentrer sur la surface de la muqueuse et cliquez sur commencer.
Concentrez-vous sur la limite inférieure de l’endroit où le signal est encore détectable et cliquez sur l’extrémité. Définissez le nombre de piles Z, en évitant les délais de plus de deux minutes pendant deux points de temps consécutifs et ouvrez le menu temps pour sélectionner minimiser et acquérir jusqu’à l’arrêt. Pour définir la moyenne de la ligne, sélectionnez chercher un, ligne moyenne deux, chercher deux, et la ligne moyenne deux.
Ensuite, pour acquérir des images, réglez le format à 1024 x 1024 pixels et la vitesse à 400 et cliquez sur démarrer. Les souris conditionnelles GGTase épithéliales intestinales spécifiques aux cellules ont développé une pathologie intestinale sévère, comme en témoigne l’augmentation du score de dommages histologiques de l’intestin grêle et l’augmentation de la perméabilité épithéliale intestinale peuvent également être détectées par le biais d’expériences in vivo traceurs utilisant le FITC-dextran administré par voie orale. Les événements d’excrétion cellulaire pourraient être identifiés comme des cellules se déplaçant hors de la monocouche épithéliale dans le lumen, conduisant à des lacunes temporaires dans le plafond de l’épithélium qui sont finalement fermés par le contact entre les cellules voisines, un soi-disant effet de fermeture éclair.
Ces lacunes sont observées chez les souris déficientes en contrôle et en GGTase, bien que la fréquence de ces phénomènes soit plus élevée chez ces dernières. Fait intéressant, d’autres cellules semblent également prendre dextran. Ces soi-disant événements cellulaires perméables se produisent également principalement chez les souris knockout conditionnelles.
L’immunostaining des protéines de jonction cytosquelette-connexes et serrées d’intérêt peut être exécutée pour identifier des cibles spécifiques qui contribuent aux perturbations épithéliales potentielles de perméabilité déterminées par microscopie intravitale. Cette méthode peut être utilisée pour l’analyse d’autres phénomènes à la surface de la muqueuse intestinale, tels que les fuites endothéliales ou la communication épithéliale immunitaire dans le contexte de l’infection intestinale.
