وECLIA هو طريقة بسيطة لكنها فعالة لتحديد مستويات الخلوية MeCP2. إن ECLIA سريع، وأكثر حساسية، وأسهل في التعامل معه مقارنة بطرق القياس الكمي الأخرى مثل البقعة الغربية و ELISA. لإعداد محلول الغسيل، وهو 0.5٪ Tween 20 في برنامج تلفزيوني، إضافة 500 ميكرولتر من توين 20 لتر واحد من برنامج تلفزيوني ومزيج بقوة.
إعداد حل حجب 3٪ مانع A وBBS ويحرك بلطف. تعقيم حل الحجب عن طريق الترشيح. لإعداد محلول diluent المقايسة ، 1 ٪ مانع A ، وبرنامج تلفزيوني ، إضافة خمسة ملليلتر من محلول حظر إلى 10 ملليلتر من برنامج تلفزيوني.
بعد ذلك ذوبان الماوس أحادي النسيلة المضادة MeCP2 الأجسام المضادة على الجليد. مزيج 0.67 ميكرولترات من الأجسام المضادة مع أربعة ملليلتر من برنامج تلفزيوني، ثم دوامة الحل. لمعطف حل لوحة ربط عالية 96-جيدا، الاستغناء بعناية 25 ميكرولترات من حل الطلاء في الزاوية السفلية من كل بئر، وذلك باستخدام أنبوبة متعددة القنوات.
داب لوحة 96-جيدا بلطف على كل جانب لضمان أن الحل طلاء يغطي الجزء السفلي من كل بئر. ختم لوحة مع احباط لاصقة، واحتضان بين عشية وضحاها في أربع درجات مئوية. استرداد لوحة 96-جيدا من الثلاجة وإزالة احباط.
إزالة محلول طلاء الأجسام المضادة في الآبار عن طريق النقر عليه في حاوية النفايات. ثم اضغط على لوحة على منشفة ورقية لإزالة أي حل المتبقية. المقبل، إضافة 125 ميكرولترات من حل حجب لكل بئر.
ثم ختم لوحة مرة أخرى مع احباط لاصقة. ضع اللوحة على متن لوحة صغيرة مدارية، تم ضبطها عند 800 دورة في الدقيقة، وحضنها لمدة 90 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. ذوبان على الجليد قارورة واحدة من MeCP2 أو تات MeCP2 محلول مخزون البروتين، lysates الدماغ الماوس، وslysates HDF.
تخفيف محلول مخزون البروتين في أنابيب نظيفة كما هو موضح في الجدول الثاني من المخطوطة. التالي يخفف عينات ال ليسات. بالنسبة لـ lysates الدماغ الماوس، استخدم 1 إلى 20 ميكروغرام لكل 25 ميكرولترات من العازلة تحلل.
بالنسبة لـ HDF، أضف 0.25 إلى ميكروغرام واحد لكل 25 ميكرولترات من عازلة التحلل. بعد أن تم احتضان لوحة 96-well لمدة 90 دقيقة، وإزالة حل حجب من الآبار عن طريق الخفقان في حاوية النفايات. ثم اضغط على لوحة على منشفة ورقية لإزالة أي حل المتبقية.
ثم غسل لوحة ثلاث مرات مع 150 ميكرولترات من محلول الغسيل، عن طريق إضافة محلول الغسيل وإزالته على الفور. إضافة 25 ميكرولترات من المعايير والعينات إلى آبار لوحة 96 جيدا. ختم لوحة واحتضانه لمدة أربع ساعات أخرى في درجة حرارة الغرفة مع ثابت 800 دورة في الدقيقة تهتز.
ذوبان الأجسام المضادة الكشف غير المُسمَّاة، الأرانب المضادة لـ MeCP2، على الجليد. باستخدام محلول مُلَيّم المقايسة، يُخفف الجسم المضاد بنسبة 1 إلى 6000. عندما يتم الانتهاء من لوحة 96-well احتضان على شاكر، وإزالة المعايير والعينات عن طريق نفض الغبار لوحة في حاوية النفايات.
ثم اضغط على لوحة على منشفة ورقية لإزالة أي حل المتبقية. اغسل الطبق ثلاث مرات مع 150 ميكرولترات من محلول الغسيل عن طريق إضافة محلول الغسيل وإزالته على الفور. إضافة 25 ميكرولترات من محلول الأجسام المضادة كشف غير المسمى إلى كل بئر مع أنبوبة متعددة القنوات.
ختم لوحة واحتضان لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة مع اهتزاز مستمر في 800 دورة في الدقيقة. الحصول على الأجسام المضادة الثانوية محددة من الثلاجة ووضعها ثلج واحد. تخفيف الجسم الثانوي في محلول diluent المقايسة ومزيج بلطف.
لإزالة الأجسام المضادة للكشف غير المُسمَّاة من لوحة 96-well، حرك في حاوية النفايات ثم انقر فوق اللوحة على منشفة ورقية. بعد غسل لوحة ثلاث مرات كما هو موضح بحسد، إضافة 25 ميكرولترات من الأجسام المضادة الثانوية إلى كل بئر مع ألواح الأنابيب متعددة القنوات. ختم لوحة واحتضان لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة مع اهتزاز مستمر في 800 دورة في الدقيقة.
إزالة الأجسام المضادة الثانوية الحرة عن طريق الخفقان في حاوية النفايات والتنصت على لوحة على منشفة ورقية ثم غسل لوحة ثلاث مرات، كما هو موضح سابقا. إلى كل بئر من لوحة، إضافة 150 ميكرولترات من 1X تريس قاعدة الذهب قراءة العازلة مع السطح، التي تحتوي على ثلاثيروبيلامين باعتباره coreactant لتوليد الضوء. لتجنب إنتاج فقاعات الهواء، استخدم تقنيات الأنابيب العكسية.
ضع لوحة 96-well على منصة microplate مع نظام الكشف عن الكيمياء الكهربائية. باستخدام المدمج في كاميرا CCD، تبدأ على الفور التقاط البيانات. عدد إشارات التسجيل التي تتوافق مع وحدات الضوء النسبية وتناسب بشكل مباشر مع شدة الضوء.
تم إنشاء منحنيات MeCP2 القياسية من MeCP2 الإنسان في قياسات متعددة. يمكن لـ ECLIA تحديد مقدار MeCP2 البشري المؤتلف بدقة على مدى نطاق يتراوح بين نانوغرام واحد لكل ملليلتر إلى 1800 نانوغرام لكل ملليلتر. باستخدام ECLIA ، تم قياس مستويات البروتين MeCP2 في الليسات النووي الدماغ من heterozygous وفئران من النوع البري الإناث ومن فأر خروج المغلوب MeCP2 واحد.
تم إجراء ECLIA على الخلايا lysates من السيطرة الصحية ومن C. 806delG خط الخلية المستخدمة كنموذج لمتلازمة ريت. لم يتم الكشف عن أي بروتين MeCP2 في خطوط الخلايا المتحولة عن طريق ECLIA أو عن طريق الفلوروس.
كما استُخدمت عملية الـ ECLIA للتحقيق في عملية استيعاب خط الخلية الناقص من طراز MeCP2 من قبل خط الخلية الناقصة. تم تحديد دقة ECLIA بين وداخل الفحص على مدى ثلاثة أيام متتالية. بالنسبة للعلاج ببدائل البروتين في المستقبل، يمكن تحسين تسليم MeCP2 بشكل متكرر بعد تقييم مستوى البروتين من قبل ECLIA.
