ECLIA, MeCP2'nin hücresel seviyelerini ölçmek için basit ama etkili bir yöntemdir. ECLIA hızlı, daha duyarlı ve Batı leke ve ELISA gibi diğer nicelik yöntemleri ile karşılaştırıldığında daha kolay işlenir. PBS'de %0,5 Ara 20 olan yıkama çözeltisini hazırlamak için 500 mikrolitre Tween 20 ila bir litre PBS ekleyin ve şiddetle karıştırın.
%3 Bloker A ve PBS'lik bir engelleme çözeltisi hazırlayın ve hafifçe karıştırın. Filtrasyon çözeltisini sterilize edin. Tazyikli dilüent çözeltisi , %1 Bloker A ve PBS'yi hazırlamak için, 10 mililitre PBS'ye beş mililitre engelleme çözeltisi ekleyin.
Sonra buz üzerinde monoklonal fare anti-MeCP2 antikor eritin. PBS dört mililitre ile antikor 0.67 mikrolitre karıştırın, sonra çözelti girdap. 96 kuyulu yüksek bağlama plakasını solüsyon kaplamak için, çok kanallı bir pipet terazisi kullanarak her kuyunun alt köşesine 25 mikrolitre kaplama çözeltisi dikkatlice dağıtın.
Kaplama çözeltisinin her kuyunun altını kapladığından emin olmak için 96 kuyulu plakayı her iki tarafa da hafifçe dab. Plakayı yapışkan folyo ile kapatın ve bir gecede dört santigrat derecede kuluçkaya yatırın. Buzdolabından 96 kuyulu tabağı alın ve folyoçıkarın.
Bir atık kabına flicking tarafından kuyularda antikor kaplama çözeltisi çıkarın. Sonra kalan çözeltikaldırmak için bir kağıt havlu üzerinde plaka dokunun. Ardından, her kuyuya 125 mikrolitre engelleme çözeltisi ekleyin.
Sonra tekrar yapışkan folyo ile plaka mühür. Plakayı 800 RPM olarak ayarlanan yörüngesel bir mikroplaka çalkalayıcıya yerleştirin ve oda sıcaklığında 90 dakika kuluçkaya yatırın. MeCP2 veya Tat-MeCP2 protein stok çözeltisi, fare beyin lysates ve HDF lysates buz bir şişe üzerinde çözülme.
El yazmasının ikinci tablosunda açıklandığı gibi protein stok çözeltisini temiz tüplerde seyreltin. Daha sonra lysate örneklerini seyreltin. Fare nin beyin lysates için, lysis tampon 25 mikrolitre başına 1 ila 20 mikrogram kullanın.
HDF lysate için, lysis tampon 25 mikrolitre başına 0,25 ila bir mikrogram ekleyin. 96 kuyulu plaka 90 dakika kuluçkaya yattıktan sonra, bir atık kabına hareket ettirerek blokaj çözeltisini kuyulardan çıkarın. Sonra kalan çözeltikaldırmak için bir kağıt havlu üzerinde plaka dokunun.
Daha sonra yıkama çözeltisini ekleyerek ve hemen çıkararak, 150 mikrolitre yıkama çözeltisi ile plakayı üç kez yıkayın. 96 kuyulu plakanın kuyularına 25 mikrolitre standart ve numune ekleyin. Plakayı kapatın ve oda sıcaklığında sabit 800 RPM sallayarak dört saat daha kuluçkaya yatırın.
Etiketsiz algılama antikorunu, çok klonal tavşan anti-MeCP2'yi buz üzerinde eritin. Titreme dilüent çözeltisi kullanarak antikoru 1 ile 6,000 arasında seyreltin. 96 kuyulu plaka shaker üzerinde kuluçka bittiğinde, bir atık konteyner içine plaka flicking tarafından standartları ve örnekleri kaldırın.
Sonra kalan çözeltikaldırmak için bir kağıt havlu üzerinde plaka dokunun. Yıkama çözeltisini ekleyerek ve hemen çıkararak tabağı 150 mikrolitre yıkama çözeltisi ile üç kez yıkayın. Çok kanallı pipetter ile her kuyuya 25 mikrolitre etiketsiz algılama antikor çözeltisi ekleyin.
Plakayı kapatın ve oda sıcaklığında bir saat boyunca 800 RPM'de sürekli sallayarak kuluçkaya yatırın. Buzdolabından belirli ikincil antikor alın ve bir buz yerleştirin. İkincil gövdeyi istinat dilüent çözeltisinde seyreltin ve hafifçe karıştırın.
96 kuyulu plakadan ücretsiz etiketsiz algılama antikorlarını çıkarmak için, atık kabın içine dinleyip plakaya kağıt havluya dokunun. Plakayı üç kez yıkadıktan sonra, çok kanallı pipetter ile her kuyuya 25 mikrolitre ikincil antikor ekleyin. Plakayı kapatın ve oda sıcaklığında bir saat boyunca 800 RPM'de sürekli sallayarak kuluçkaya yatırın.
Atık kabın içine flicking ve bir kağıt havlu üzerinde plaka dokunarak serbest ikincil antikor çıkarın ve daha önce açıklandığı gibi, üç kez plaka yıkayın. Plakanın her kuyusuna, 1X Tris baz Altın Okuma Tampon'una 150 mikrolitre ekleyip, ışık üretimi için bir eşregülan olarak tripropilamin içeren sürfaktanlı bufferı ekleyin. Hava kabarcıkları üreten önlemek için, ters pipetleme teknikleri kullanın.
Elektrokemilüminesans algılama sistemi ile mikroplaka platformu üzerinde 96-iyi plaka yerleştirin. Dahili CCD kamerayı kullanarak, hemen veri yakalamaya başlayın. Göreceli ışık birimlerine karşılık gelen ve ışığın yoğunluğuyla doğru orantılı olan kayıt sinyali sayıları.
MeCP2 standart eğrileri birden fazla ölçümde insan MeCP2'den üretildi. ECLIA, rekombinant insan MeCP2'yi mililitre başına bir nanogramile mililitre de 1800 nanogram arasında doğru bir şekilde ölçebilir. ECLIA kullanılarak, MeCP2 protein düzeyleri heterozigot ve dişi yabani farelerden ve bir MeCP2 nakavt faresinden beyin nükleer lysates ölçüldü.
ECLIA, sağlıklı bir kontrolden hücre lysates ve Rett sendromu için model olarak kullanılan c. 806delG hücre hattından yapılmıştır. Mutant hücre hatlarında ECLIA veya immünororesans ile MeCP2 proteini saptırılmadı.
ECLIA ayrıca MeCP2 eksik hücre hattı fazla mesai tarafından Tat-MeCP2 alımını araştırmak için kullanılmıştır. ECLIA inter ve intra tsay hassasiyeti üç gün üst üste belirlendi. Gelecekteki protein replasman tedavisi için, MeCP2 doğumu ECLIA tarafından protein düzeyi değerlendirmesinden sonra tekrar tekrar optimize edilebilir.
