腺病毒生产的有效方法

欢迎来到来自罗马尼亚布加勒斯特的细胞生物学和病理学研究所。在病毒转导实验室，我们使用基于沃格尔斯坦教授开发的 AdEasy 系统的优化方法展示了腺病毒粒子生产的一部分。生产这种腺病毒技术的主要步骤是，一是重新组合含有GFP的pAdTrack与BJ5183细菌中的pAdEasy-1质粒。

二、包装腺苷颗粒。三、放大AD293细胞中的腺病毒。四、从细胞水酸盐和培养基中净化腺苷酸颗粒。

五、腺病毒的病毒滴定和功能测试。在这里，我们将介绍方法的重要一步。从细胞水酸盐和培养基中净化腺苷酸颗粒。

腺病毒的净化从收获产生病毒的细胞和媒介开始。AD293细胞被重组的质粒和腺病毒包装而变质。然后腺病毒被连续的大文化放大。

在这里，我们获得了25个T175板，我们开始从细胞利萨酸盐和文化介质净化腺病毒。首先，我们检查了转基因细胞表达的GFP的绿色荧光。如果细胞仍然连接，我们将通过敲击培养皿或使用长刮刀分离它们。

细胞和介质被收集。烧瓶用PBS清洗，PBS也收集在猎鹰管中。这些细胞通过离心来撬动。

保留细胞颗粒以及进一步净化腺病毒的介质。在这一步，同事的帮助是值得赞赏的，以加快收获过程。由于 GFP 表达，细胞颗粒是绿色的。

颗粒在超音速三叉星缓冲器中恢复，这将有助于细胞的破坏。对于细胞裂解，我们使用液氮和干气加热高达37度。由于病毒会受损，不要执行超过三个周期。

为了提高细胞破坏的效率，通过23号仪表注射针小心地将细胞均质化。将细胞的离心解液在9，600 x g下，12分钟。将超自然物通过新管中，然后丢弃颗粒。

将超自然体保存在冰上，以进行超中心燃料的进一步加工。现在，我们处理培养介质，以隔离从细胞释放的腺病毒。为此，首先，我们称量硫酸铵的必要量，并将其添加到收集培养介质的瓶子中。

瓶子剧烈摇晃，直到晶体完全溶解。混合物在室温下孵育两个半小时。然后沉淀物的悬架被分成猎鹰管。

离心机在 1，600 x g 时 15 分钟。离心后，超自然物被丢弃，颗粒在10毫升的Tris缓冲器中再接再用。如果无法通过超集中式步骤继续净化腺病毒，沉淀物可能保持在四度，但只有在透析后才能去除硫酸铵。

在这里，我们介绍了透析步骤。我们使用注射器将悬架引入以前湿润的盒式磁带中。样品在四度隔夜对10毫升三叶草缓冲器进行透析。

净化的最后一步是氯化钠不连续梯度的超集中式步骤。为了形成梯度，首先，我们移液三毫升高密度溶液氯化钠。在此层的顶部，轻轻倒入三毫升低密度氯化钠。

然后，细胞赖酸或培养介质的腺苷酸颗粒悬浮物覆盖在梯度之上。管子充满矿物油，并引入 SW41 桶中。平衡后，管子对称地加载到转子中，转子引入超中心。

离心机运行35，000 RPM和4度，连续18小时不间断。超集中后，管子被放置在一个支架上，后面放着一张黑纸，以便收获带子。清晰的上部阶段和细胞碎片被丢弃在带有漂白溶液的废物容器中。

包含完整腺病毒的最低带用移液器尖端收获，并收集在无菌的埃彭多夫管中。透析后，蔗糖被添加到病毒悬浮到4%的最终浓度和病毒别名保持冻结在零下80度。在结果部分，我们展示了与获得腺病毒一起转化的细胞中的GFP表达。

转导后48小时，GFP由荧光显微镜显示的转导细胞表达。GFP表达细胞的百分比由流动细胞学决定。大约50%的人类和牛内皮细胞与每个细胞25个转导单元的转化是GFP阳性。

当每个细胞只使用5个转导单元时，对穆林肝细胞获得了相同的转导产量，但由于细胞敏感性，这与死亡率较高有关。由于特定受体的低表达，通过间质频闪细胞的转导获得降低到GFP表达。结束语。

我们优化这些费力的技术，以减少获得腺苷颗粒所需的时间、成本和努力。准备的腺病毒能够感染各种细胞类型，并诱导兴趣基因的表达。