Benvenuti all'Istituto di Biologia e Patologia Cellulare, Nicolae Simionescu di Bucarest, Romania. Qui nel Laboratorio di Trasduzione Virale, Mostriamo una parte della produzione di particelle adenovirali utilizzando una metodologia ottimizzata basata sul sistema AdEasy sviluppato dal professor Vogelstein. I passaggi principali della tecnologia per la produzione di questi adenovirus sono, uno, una ricombinazione di pAdTrack contenente GFP con il plasmide pAdEasy-1 nei batteri BJ5183.
Due, immialare le particelle adenovirali. Tre, amplificazione dell'adenovirus nelle cellule AD293. Quattro, purificazione delle particelle adenovirali dal litorato cellulare e dal mezzo di coltura.
Cinque, titolazione virale e test funzionali dell'adenovirus. Qui presenteremo un passo importante della metodologia. La purificazione delle particelle adenovirali dal litorato cellulare e dal mezzo di coltura.
La purificazione dell'adenovirus inizia con la raccolta delle cellule produttrici di virus e del mezzo. Le cellule AD293 sono state trasfette con il plasmide ricombinante e come l'adenovirus è stato confezionato. Quindi l'adenovirus è stato amplificato da successive culture più grandi.
Qui, abbiamo ottenuto 25 piastre T175, e abbiamo iniziato la purificazione dell'adenovirus dal lisato cellulare e dal mezzo di coltura. In primo luogo, abbiamo controllato la fluorescenza verde del GFP espressa dalle cellule trasdutte. Se le cellule sono ancora attaccate, le staccaremo toccando il piatto di coltura o usando un raschietto lungo.
Le cellule e il mezzo vengono raccolti. I contenitori vengono lavati con PBS, che viene raccolto anche in tubi Falcon. Le cellule sono pellettate dalla centrifugazione.
Conservare il pellet cellulare e il mezzo per un'ulteriore purificazione dell'adenovirus. In questa fase, l'aiuto di un collega è ben apprezzato per accelerare il processo di raccolta. Il pellet cellulare è verde a causa dell'espressione GFP.
Il pellet viene rimosodito in tampone Tris ipertonico, il che faciliterebbe l'interruzione delle cellule. Per la lisi cellulare, utilizziamo azoto liquido e il gas secco riscaldato fino a 37 gradi. Non eseguire più di tre cicli poiché il virus sarebbe danneggiato.
Per aumentare l'efficienza dell'interruzione cellulare passare con cura l'omogeneizzazione cellulare attraverso un ago siringa calibro 23. Centrifugare il llysate cellulare a 9.600 x g per 12 minuti. Passare il supernatante in nuovi tubi e scartare il pellet.
Mantenere il supernatante sul ghiaccio per un'ulteriore lavorazione con ultracentrifugo. Ora, emoboriamo il mezzo di coltura per isolare l'adenovirus rilasciato dalle cellule. Per questo, in primo luogo, pesiamo la quantità necessaria di solfato di ammonio e lo aggiungiamo alla bottiglia in cui è stato raccolto il mezzo di coltura.
La bottiglia viene agitare vigorosamente fino a quando i cristalli non vengono completamente sciolti. La miscela viene incubata a temperatura ambiente per due ore e mezza. Quindi la sospensione del precipitato è divisa in tubi Falcon.
Centrifuga per 15 minuti a 1.600 x g. Dopo la centrifugazione, il supernatante viene scartato e il pellet viene rimescolato in tampone Tris da 10 millimolare. Se non si può continuare la purificazione dell'adenovirus con la fase di ultracentrifugazione, il precipitato può essere mantenuto per alcuni giorni a quattro gradi, ma solo dopo la dialisi per rimuovere il solfato di ammonio.
Qui, abbiamo presentato la fase di dialisi. Usiamo una siringa per introdurre la sospensione in una cassetta precedentemente bagnata. I campioni vengono dializzati contro il tampone Tris da 10 millimolare durante la notte a quattro gradi.
La fase finale della purificazione è rappresentata dalla fase di ultracentrifugazione su un gradiente discontinuo di cloruro di cesio. Per formare il gradiente, in primo luogo, pipettamo tre millilitri della soluzione ad alta densità di cloruro di cesio. Oltre a questo strato, versare delicatamente tre millilitri di cloruro di cesio a bassa densità.
La sospensione della particella adenovirale dal lisato cellulare o dal mezzo di coltura viene quindi sovrapposta al gradiente. I tubi sono riempiti con olio minerale e introdotti nelle benne SW41. Dopo l'equilibrazione, i tubi vengono caricati simmetricamente nel rotore, che viene introdotto nell'ultracentrifugo.
La centrifuga esegue un 35.000 giri/min e quattro gradi per 18 ore senza pausa. Dopo l'ultracentrifugazione, i tubi vengono posizionati su un supporto con una carta nera dietro per raccogliere le bande. La fase superiore chiara e i detriti cellulari vengono scartati in un contenitore di rifiuti con una soluzione di sbiancamento.
La fascia più bassa contenente l'adenovirus completo viene raccolta con una punta di pipetta e raccolta in un tubo sterile di Eppendorf. Dopo la dialisi, il saccarosio viene aggiunto alla sospensione virale a una concentrazione finale del 4% e l'aliquota virale viene mantenuta congelata a meno 80 gradi. Nella sezione risultati, abbiamo mostrato l'espressione GFP nelle cellule trasdotto con l'adenovirus ottenuto.
48 ore dopo la trasduzione, la GFP è espressa dalle cellule trasdutte come mostrato dalla microscopia a fluorescenza. La percentuale delle cellule che esprimono la GFP è determinata dalla citometria del flusso. Circa il 50% delle cellule endoteliali umane e bovine trasdotto con 25 unità di trasduzione per cellula sono positive alla GFP.
La stessa resa di trasduzione è stata ottenuta per gli epatociti murini quando sono state utilizzate solo cinque unità di trasduzione per cellula, ma questo è associato a una maggiore mortalità dovuta alla sensibilità cellulare. Ridotto all'espressione della GFP è stato ottenuto per trasduzione di cellule stromali mesenchimali a causa della bassa espressione dei recettori specifici. Osservazioni conclusive.
Ottimizziamo queste laboriose tecnologie per ridurre il tempo, i costi e lo sforzo necessario per ottenere le particelle adenovirali. L'adenovirus preparato è in grado di infettare vari tipi di cellule e di indotta l'espressione del gene di interesse.
