هذا البروتوكول هو بوابة المصفوفة خارج الخلية. انها التعقيد وهيكلها وصولا الى نطاق دون ميكرون. وبالتالي فإن الميزة الرئيسية لهذه الطريقة هي أنه يجعل من الممكن الحصول على مصفوفة خارج الخلية التي تحتفظ بسلامتها الهيكلية وبالتالي فتح الطريق للتحليل الكيميائي الحيوي والتشريحي.
وسيكون من بين التدليل على الإجراء، أليخاندرو مايوركا جيلاني، ورافائيل توتن، وماريا رافايفا، الموجودون حاليا في مختبري وكريس مادسن، والذي كان في مختبري وواصل العمل في جامعة لوند. ابدأ بحلق الصدر والبطن وظهر الماوس القتل الرحيم بمقص شعر. تطهير المنطقة مع 70٪ الإيثانول.
ثم دبوس الماوس إلى صينية البوليسترين، وتمديد أطرافه الخلفية نهاية أربعة، فضلا عن رأسه والذيل. ضعه تحت مجهر الجراحة المجهرية. باستخدام مقص نمط مستقيم مايو، وجعل شق جلدي يمتد من المنطقة السفلية الفك السفلي إلى أسفل البطن وتشريح تحت الجلد لفضح جدار الصدر والحمور.
ثم استخدم مقص الجراحة الدقيقة لقطع العضلات الصدرية الرئيسية والصدرية البسيطة على طول المساحة الوربية السادسة على جانبي الجدار الصدري. قطع القص على طول الشقوق السابقة مع مقص نمط مستقيم. ثم إكمال استئصال القص عن طريق قطع القص على طول محورها الطويل.
رفع ودبوس، كلا الجانبين من الجدار الصدري لفضح مجمع القلب والعقدة الرئوية. استخدام ملقط صغير مستدير يميل لاستئصال الغدة الصعترية والأنسجة الدهنية المحيطة بها عن طريق سحب بدقة لهم قبالة المرفقات الخاصة بهم. وقطع المريء بمقص صغير.
فصل الأوردة brachiocephalic والشريان العضدي مع ملقط صغير حاد. ثم فصل السباتية الشائعة اليسرى والشرايين تحت الترقوة اليسرى من الأنسجة الأساسية لتسهيل الربط والكي. استخدام حامل microneedle والملقط الدقيق الحاد وتسعة يا خياطة لوضع غرز فوق ظهور brachiocephalic اليسار السباتية المشتركة والشرايين تحت الترقوة اليسرى، الكي الأوردة brachiocephalic.
باستخدام مقص صغير، افتح مدخلا عن طريق تقسيم الرباط. إدخال قسطرة قياس 27 في القصبة الهوائية ودفع بدقة حتى فروع القصبة الهوائية في القصبات الهوائية، مع الحرص على عدم تعطيل القصبات الهوائية. باستخدام ستة خياطة O، ضع ثلاث غرز حول القصبة الهوائية لتأمين القسطرة.
قسم الماوس في ذروة الفقرة الصدرية 12th ، الشريان الأورطي التنازلي يمتد من قبل إلى العمود الفقري ، وينبغي تقسيم هنا جنبا إلى جنب مع العمود الفقري. القسطرة إلى الوراء الشريان الأورطي ودفع القسطرة حتى تصل إلى القوس الأبهري. باستخدام خياطة، ضع أربع غرز حول الشريان الأورطي، بداية من خمسة ملليمترات تحت طرف القسطرة.
قم بتوصيل الماوس بنظام مضخة باستخدام أنابيب السيليكون والموصلات السفلية. Perfuse مع الماء deionized في 200 ميكرولتر في الدقيقة الواحدة لمدة 15 دقيقة. ثم تغيير عامل التشوه إلى 0.5٪ DOC، مخففة في الماء deionized وتغلغل بين عشية وضحاها.
في اليوم التالي، تغيير عامل التشوه إلى 0.1٪ SDS المخفف في الماء deionized، و perfuse لمدة ثماني ساعات. ثم perfuse مع الماء deionized لمدة 24 ساعة لغسل SDS وDOC. إعادة استئصال القلب والرئتين decellularized عن طريق تقسيم ملحقاتها إلى الصدر.
تخزين الأنسجة في أنبوب التبريد العقيم في الماء deionized مع 1٪ ستريبتوميسين البنسلين و 0.3 ميكرومولار الصوديوم azide في أربع درجات مئوية. لإجراء تلطيخ المناعة، قم بحجب العينة عن طريق احتضانها في أنبوب التبريد الذي يحتوي على مصل حمار بنسبة 6٪ و3٪ BSA بين عشية وضحاها. ثم احتضان مع الأجسام المضادة الأولية في مصل حمار 3٪ في برنامج تلفزيوني لمدة 24 ساعة.
بعد الحضانة غسل العينة خمس مرات في PBST لمدة ساعة واحدة لكل غسل. احتضان العينة مع الأجسام المضادة الثانوية المقترنة الفلورية في مصل حمار 3٪ في برنامج تلفزيوني لمدة 24 ساعة. ثم كرر يغسل في PBST.
أضف الماء المؤين وخزن العينة على بعد أربع درجات مئوية من الضوء المباشر. لتصوير العينة، ضعها في طبق زجاجي أسفل وترطيبها برذاذين من محلول التخزين. حدد الهدف وافحص العينة باستخدام ضوء الفلورسينس.
التبديل إلى التحكم في الكمبيوتر، وتشغيل أشعة الليزر وضبط كثافة الليزر، فتحة الثقب، والكاشفات الطول الموجي، وكسب، والقرار والتكبير. تعيين رقم وحجم الخطوة مكدس Z، ثم ابدأ اقتناء. استئصال فص الرئة واحد من فأر القتل الرحيم ووضعه في 10 في 10 في خمسة ملليمتر قالب التبريد.
تغطية ذلك مع ما يقرب من 500 ميل ميكرولتر من مركب أكتوبر وتجميده على الجليد الجاف. حافظ على العينة عند درجة الحرارة تلك. استئصال واحد فص الرئة decellularized من الماوس المعالجة، ووضعه في قالب التبريد مع أكبر مساحة السطح إلى أسفل وتغطيتها مع مركب أكتوبر.
تجميد العينة على الجليد الجاف والحفاظ عليها في درجة الحرارة تلك حتى المطلوبة خلاف ذلك. يمكن تخزين العينة لمدة 12 أسبوعا على الأقل. استخدام cryostat إلى قسم كتل الأنسجة المجمدة في خمسة أقسام ميكرومتر في ناقص 20 درجة مئوية.
ووضع المقاطع على الشرائح الزجاجية اللاصقة. نقل الشرائح إلى درجة حرارة الغرفة حتى يجف الهواء. تزج لفترة وجيزة الشرائح في برنامج تلفزيوني، تليها 4٪ paraformaldehyde في برنامج تلفزيوني لمدة 15 دقيقة.
يغسل مرة واحدة في برنامج تلفزيوني، ثم مرتين في الماء المقطر لمدة خمس دقائق لكل غسل. تزج الشرائح في محلول الهيماتوكسيلين ماير لمدة 10 دقائق. بعد ذلك ، اغسل الشرائح في جرة كوبلاند تحت الماء المقطر الجاري لمدة 10 دقائق وانغمس في محلول eosin لمدة سبع دقائق.
تراجع في الزيلين عدة مرات. تطبيق بضع قطرات من DPX تصاعد المتوسطة ووضع زلة غطاء زجاجي. اترك الشرائح لتجف بين عشية وضحاها تحت غطاء محرك السيارة الكيميائي ثم قم بمسحها ضوئيا في ماسح ضوئي للشرائح.
بعد الانتهاء بنجاح من البروتوكول، والقلب والرئتين والأنسجة NX تكون خالية من الخلايا. يمكن التحقق من صحة إزالة الخلايا عن طريق تلطيخ الهيماتوكسيلين إيوزين من سقالات ECM. تحتفظ السقالات بأبعاد الأعضاء الطازجة وهيكل ECM القابل للانزيم سليم.
وأظهرت سقالات ECM زيادة نفاذية و penetrability الخفيفة. باستخدام هذا البروتوكول مع مرحلة المجهر الآلي يسمح للتصوير البلاط ثلاثي الأبعاد من عينات جبل كله في دقة ميكرون الفرعية. من الضروري تجنب التدفق نحو الأجهزة ذات الاهتمام لتحقيق التكبيل الموحد الكامل.
يجب أن يكون تشريح الأوعية وربطها جراحيا فعالا. وفي الوقت نفسه احترام الأنسجة المستهدفة للحفاظ على بنية VCM الأصلية. بعد هذا الإجراء، سيتم إثراء السقالات لبروتينات ECM الهيكلية ويمكن استخدامها لقياس الطيف الكتلي أو هندسة الأنسجة.
تمهد هذه التقنية الطريق إلى رسم خرائط عالية الدقة للمصفوفة خارج الخلية.
