이 프로토콜은 세포외 행렬에 대한 게이트웨이입니다. 그것은 복잡성과 하위 미크로네 규모까지의 구조입니다. 따라서 이 방법의 주요 장점은 구조적 무결성을 유지하는 세포외 매트릭스를 얻을 수 있게 하여 생화학 및 해부학 적 분석의 길을 열어준다는 것입니다.
절차를 시연하는 것은 알레한드로 마요르카 길라니, 라파엘 루텐, 마리아 라파에바, 현재 내 실험실과 크리스 매드슨에 있었고 누가 내 실험실에 있었고 룬드 대학에서 작업을 계속했다. 모발 클리퍼로 안락사 마우스의 흉부, 복부 및 뒷면을 면도하여 시작합니다. 70%에탄올로 이 지역을 소독합니다.
그런 다음 마우스를 폴리스티렌 트레이에 고정하여 네 개의 끝 뒷다리와 머리와 꼬리를 확장합니다. 미세 수술 현미경 아래에 놓습니다. 마요 직선 패턴 가위를 사용하여, 하부 부위에서 하복부로 의한 배분 절개를 하고 흉부 벽과 복막을 노출하도록 피하한다.
그런 다음 흉부 벽의 양쪽에 있는 여섯 번째 늑간 공간을 따라 가슴 경 전공을 절단하고 가슴 경 경미한 근육을 잘라 미세 수술 가위를 사용합니다. 직선 패턴 가위로 이전 절개를 따라 흉골을 자른다. 그런 다음 긴 축을 따라 흉골을 절단하여 스터노절제술을 완료합니다.
고양및 핀, 흉부 벽의 양쪽은 심폐 복합체를 노출합니다. 둥근 기울어진 마이크로 포셉을 사용하여 흉선과 주변 지방 조직을 섬세하게 잡아 당겨 서 부착물을 제거합니다. 그리고 마이크로 가위로 식도를 잘라냅니다.
날카로운 마이크로 집게와 brachiocephalic 동맥을 분리합니다. 그런 다음 왼쪽 공통 경동맥을 분리하고 혈관분해와 소작을 용이하게 하기 위해 기본 조직으로부터 서브클라비아 동맥을 분리합니다. 마이크로니들 홀더와 날카로운 마이크로 집게와 9개의 오 봉합사를 사용하여 브라치오페할릭왼쪽 공통 경동맥과 좌측 서브클라비아동맥의 출현 위에 바늘을 놓고 브라치오페할릭 정맥을 소작한다.
마이크로 가위를 사용하여 인대를 단면화하여 입구를 엽니다. 기관지에 27 게이지 카테터를 도입하고 기관지가 기관지에 들어갈 때까지 섬세하게 밀어 내어 기관지를 방해하지 않도록 주의하십시오. 6O 봉합사를 사용하여 카테터를 확보하기 위해 기관 주위에 3 개의 바늘을 놓습니다.
12 흉부 척추의 높이에서 마우스를 절제하고, 내림차순 아오르타는 척추에 전방으로 실행하고 척추와 함께 여기에 단면해야합니다. Aorta를 개조하고 대동맥 호에 도달할 때까지 카테터를 밀어 넣습니다. 봉합사를 사용하여 카테터 팁 아래 5밀리미터에서 시작하여 아오르타 주변에 4개의 바늘을 놓습니다.
실리콘 튜빙과 낮은 커넥터를 사용하여 마우스를 펌프 시스템에 연결합니다. 분당 200 마이크로리터에서 15분 동안 탈화된 물로 퍼퓨즈합니다. 그런 다음 관류제를 0.5%DOC로 변경하고, 탈이온화된 물에 희석하고 밤새 퍼퓨즈합니다.
다음날, 회류제를 탈화된 물에 희석한 0.1%SDS로 변경하고 8시간 동안 퍼퓨즈한다. 그런 다음 SDS와 DOC를 씻어 24 시간 동안 탈화된 물로 퍼퓨징하여 흉부에 부착물을 분리하여 탈세포 된 심장과 폐를 다시 씻어 내보도록 합니다.
멸균 저온 튜브에 1%페니실린 연쇄상 구균및 섭씨 4도에 0.3 마이크로몰라 나트륨 아지드를 사용하여 분해된 물에 조직을 저장합니다. 면역 염색을 수행하기 위해, 하룻밤 6 %의 당나귀 혈청과 3 %BSA를 포함하는 냉동 튜브에서 인큐베이팅하여 샘플을 차단합니다. 그런 다음 PBS에서 3%당나귀 혈청에서 24시간 동안 1차 항체로 배양한다.
인큐베이션 후 세척당 1시간 동안 PBST에서 샘플을 5회 세척합니다. PBS에서 3%당나귀 혈청에서 형광으로 공주된 이차 항체를 24시간 동안 배양한다. 그런 다음 PBST에서 세서를 반복합니다.
이온화된 물을 추가하고 직접 조명에서 섭씨 4도에 샘플을 저장합니다. 샘플을 이미지화하려면 유리 바닥 접시에 넣고 두 방울의 저장 액으로 가습하십시오. 목표를 설정하고 형광광을 사용하여 샘플을 검사합니다.
컴퓨터 제어로 전환, 레이저를 켜고 레이저 강도, 핀홀 조리개, 검출기 파장, 게인, 해상도 및 줌을 조정합니다. Z 스택의 숫자와 단계 크기를 설정한 다음 인수를 시작합니다. 안락사 된 마우스에서 하나의 폐 엽을 소비하고 5 밀리미터 저온 금형에 의해 10 10 10에 배치합니다.
약 500마일의 100마일 마이크로리터의 OCT 화합물로 덮고 드라이 아이스에 얼립니다. 샘플을 해당 온도에서 유지관리합니다. 가공 된 마우스에서 탈세포 폐 엽 하나를 소비하고, 아래로 가장 큰 표면적을 가진 냉동 금형에 배치하고 OCT 화합물로 덮습니다.
드라이 아이스에 샘플을 동결하고 그렇지 않으면 필요할 때까지 그 온도에서 유지합니다. 샘플은 적어도 12 주 동안 저장할 수 있습니다. 냉동 조직 블록을 영하 20도의 5마이크로미터 섹션으로 섹션화하려면 저온을 사용하십시오.
그리고 접착제 유리 슬라이드에 섹션을 배치합니다. 공기가 건조 될 때까지 슬라이드를 실온으로 옮기십시오. PBS에서 슬라이드를 잠깐 몰입하고 PBS에서 4 %의 파라포름알데히드를 15 분 동안 담가 두십시오.
PBS에서 한 번 씻은 다음, 세척당 5분 동안 증류수로 두 번 씻습니다. 마이어의 헤마톡슬린 솔루션에 10분 간 슬라이드를 담그십시오. 다음으로, 10 분 동안 증류수 아래 코플랜드 항아리에 슬라이드를 세척하고 7 분 동안 eosin 용액에 담급.
자일렌에 여러 번 찍어. DPX 장착 중간 크기의 몇 방울을 바르고 유리 커버 슬립을 놓습니다. 슬라이드를 화학 후드 아래에서 밤새 건조한 다음 슬라이드 스캐너에서 스캔합니다.
프로토콜을 성공적으로 완료한 후 심장과 폐 및 NX 조직은 세포가 없습니다. 탈세포화는 ECM 스캐폴드의 헤마톡시린 에신 염색에 의해 검증될 수 있다. 비계는 신선한 장기의 치수를 유지하고 그 부전적 ECM 구조는 그대로입니다.
ECM 스캐폴드는 투과성 및 광 침투성이 증가하는 것으로 나타났다. 전동 현미경 단계와 이 프로토콜을 사용하면 서브 미크론 해상도에서 전체 마운트 샘플의 3차원 타일 이미징을 허용합니다. 완전한 균일 한 탈화를 달성하기 위해 관심기관을 향해 흐름을 피하는 것이 필수적입니다.
혈관의 미세 수술 해부 및 결찰이 효과적이어야합니다. 그리고 동시에 네이티브 VCM 구조를 유지하기 위해 대상 조직을 존중한다. 이 절차에 따라, 비계는 구조 적인 ECM 단백질을 위해 풍부하게 될 것이고 질량 분광법 또는 조직 공학을 위해 사용될 수 있습니다.
이 기술은 세포외 매트릭스의 고해상도 매핑을 위한 길을 열어줍니다.
