该协议是细胞外基质的网关。它的复杂性和结构低至亚微米级。因此，这种方法的关键优点是，它使得获得保持其结构完整性的细胞外基质成为可能，从而为生化和解剖学分析开辟了道路。
演示该过程的将是Alejandro Mayorca Gilani，Raphael Reuten和Maria Rafaeva，他们目前在我的实验室和Chris Madsen，他在我的实验室并继续在隆德大学工作。首先用理发器剃掉安乐死小鼠的胸部，腹部和背部。用70%乙醇消毒该区域。
然后将鼠标固定在聚苯乙烯托盘上，伸展其四端后肢以及头部和尾巴。将其放在显微外科显微镜下。使用Mayo直型剪刀，做一个从下颌下区域到下腹部的皮肤切口，皮下解剖以暴露胸壁和腹膜。
然后使用显微外科剪刀沿着胸壁两侧的第六肋间间隙切除胸大肌和胸小肌。用直纹剪刀沿着以前的切口切开胸骨。然后通过沿胸骨长轴切割胸骨来完成胸骨切开术。
抬高并固定胸壁两侧，以暴露心肺复合体。使用圆形尖端的微镊子通过巧妙地将其从附着物上拉出胸腺和周围的脂肪组织来切除胸腺和周围的脂肪组织。并用微型剪刀切开食道。
用锋利的微钳将臂头静脉和肱头动脉分开。然后将左颈总动脉和左锁骨下动脉与下层组织分开，以促进结扎和烧灼。使用微针支架和锋利的微钳和九哦缝合线，在臂头左颈总动脉和左锁骨下动脉的出现上方放置缝线，烧灼肱头静脉。
使用微型剪刀，通过切开韧带打开入口。将27号导管引入气管，并小心地推动，直到气管分支进入支气管，注意不要破坏支气管。使用六O缝合线，在气管周围缝合三针以固定导管。
将小鼠切在第12胸椎的高度，下降的主动脉向前延伸到脊柱，并应与脊柱一起在这里切片。逆行导管导管主动脉并推动导管直至到达主动脉弧。使用缝合线，在主动脉周围放置四针，从导管尖端下方五毫米开始。
使用硅胶管和下部连接器将鼠标连接到泵系统。用去离子水以每分钟200微升的速度浸泡15分钟。然后将灌注剂更换为0.5%DOC，在去离子水中稀释并灌注过夜。
第二天，将灌注剂更换为0.1%SDS，在去离子水中稀释，并灌注8小时。然后用去离子水灌注24小时，洗去SDS和DOC.通过切除其与胸部的附着物来切除去细胞化的心脏和肺部。
将组织储存在无菌冷冻管中，在去离子水中加入1%青霉素链霉素和0.3微摩尔叠氮化钠，温度为4摄氏度。要进行免疫染色，通过将样品在含有6%驴血清和3%BSA的冷冻管中孵育过夜来阻断样品。然后用一抗在PBS的3%驴血清中孵育24小时。
孵育后，将样品在PBST中洗涤五次，每次洗涤一小时。将样品与荧光偶联的二抗在PBS的3%驴血清中孵育24小时。然后以 PBST 重复洗涤。
加入离子水，将样品储存在四摄氏度，远离直射光。要对样品进行成像，将其置于玻璃底皿中，并用两滴储存溶液加湿。设置物镜并使用荧光灯检查样品。
切换到计算机控制，打开激光并调整激光强度，针孔孔径，探测器波长，增益，分辨率和变焦。设置 Z 堆栈的数量和步长，然后开始采集。从安乐死小鼠身上切除一个肺叶，并将其放入10×10×5毫米的冷冻模具中。
用大约500英里微升的OCT化合物覆盖它，并将其冷冻在干冰上。将样品保持在该温度。从加工过的小鼠身上切除一个去细胞化的肺叶，将其置于具有最大表面积的冷冻模具中，并用OCT化合物覆盖。
将样品冷冻在干冰上，并将其保持在该温度，直到另有要求。样品可以储存至少12周。使用低温恒温器在零下20摄氏度下将冷冻的组织块切成五微米切片。
并将这些部分放在粘性载玻片上。将载玻片转移到室温直至风干。将载玻片短暂浸入PBS中，然后在PBS中浸泡4%多聚甲醛15分钟。
在PBS中洗涤一次，然后在蒸馏水中洗涤两次，每次洗涤五分钟。将载玻片浸入Myer的苏木精溶液中10分钟。接下来，在谷轮罐中，在蒸馏水下洗涤载玻片10分钟，然后浸入曙红溶液中7分钟。
浸入二甲苯中几次。涂抹几滴 DPX 安装介质，然后放置玻璃盖板。将载玻片放在化学罩下干燥过夜，然后在玻片扫描仪中扫描它们。
成功完成实验方案后，心脏、肺和NX组织将没有细胞。可以通过ECM支架的苏木精曙红染色来验证去细胞化。支架保留了新鲜器官的尺寸，其不透明的ECM结构完好无损。
ECM支架的渗透率和光穿透性增加。将此协议与电动显微镜载物台一起使用，可以以亚微米分辨率对整个安装样品进行三维平铺成像。必须避免流向感兴趣的器官，以实现完全均匀的脱模。
血管的显微外科解剖和结扎必须有效。同时尊重目标组织以维持天然VCM结构。按照该过程，支架将富集结构ECM蛋白，可用于质谱或组织工程。
这种技术为细胞外基质的高分辨率映射铺平了道路。
