Dieses Protokoll ist das Tor zur extrazellulären Matrix. Es ist Komplexität und ihre Struktur bis in den Submikron-Maßstab. Der Hauptvorteil dieser Methode besteht also darin, dass sie es ermöglicht, eine extrazelluläre Matrix zu erhalten, die ihre strukturelle Integrität beibehält und so den Weg für biochemische und anatomische Analysen ebnet.
Das Verfahren werden von Alejandro Mayorca Gilani, Raphael Reuten und Maria Rafaeva, derzeit in meinem Labor und Chris Madsen, der in meinem Labor war und die Arbeit an der Universität Lund fortsetzte, demonstriert. Beginnen Sie mit der Rasur des Brustkorbs, des Bauches und des Rückens der eingeschläferten Maus mit einer Haarschneidemaschine. Desinfizieren Sie den Bereich mit 70% Ethanol.
Dann befestigen Sie die Maus an einer Styroporschale und verlängern Sie ihre vier Hinterbeine sowie kopf und schwanz. Legen Sie es unter das mikrochirurgische Mikroskop. Machen Sie mit einer Mayo-Schere mit geradem Muster einen Hautschnitt, der von der submandibulären Region zum Unterbauch verläuft, und sezieren Sie subkutan, um die Brustwand und das Peritoneum freizulegen.
Verwenden Sie dann eine mikrochirurgische Schere, um die Muskeln Pectoralis major und Pectoralis minor entlang des sechsten Interkostalraums auf beiden Seiten der Brustwand zu schneiden. Schneiden Sie das Brustbein entlang der vorherigen Schnitte mit einer geraden Musterschere. Schließen Sie dann eine Sternotomie ab, indem Sie das Brustbein entlang seiner Längsachse schneiden.
Heben und stiften Sie beide Seiten der Brustwand, um den kardiopulmonalen Komplex freizulegen. Verwenden Sie eine runde Mikrozange, um den Thymus und das umgebende Fettgewebe zu entfernen, indem Sie sie vorsichtig von ihren Anbauteilen abziehen. Und schneiden Sie die Speiseröhre mit einer Mikroschere ab.
Trennen Sie die brachiozephalen Venen und die Arteria brachiocephalica mit einer scharfen Mikrozange. Trennen Sie dann die linken gemeinsamen Carotis- und linken Subclaviaarterien vom darunter liegenden Gewebe, um die Ligatur und Kauterisation zu erleichtern. Verwenden Sie einen Mikronadelhalter und eine scharfe Mikrozange und eine Neun-Oh-Naht, um Stiche über die Entstehung der brachiocephalen linken Halsschlagader und der linken Subclavia-Arterien zu legen, kauterisieren Sie die brachiozephalen Venen.
Öffnen Sie mit einer Mikroschere einen Eingang, indem Sie das Band schneiden. Führen Sie einen 27-Gauge-Katheter in die Luftröhre ein und drücken Sie vorsichtig, bis sich die Luftröhre in die Bronchien verzweigt, wobei darauf zu achten ist, dass die Bronchien nicht gestört werden. Legen Sie mit einer Sechs-O-Naht drei Stiche um die Luftröhre, um den Katheter zu sichern.
Schnitt die Maus auf Höhe des 12. Brustwirbels, verläuft die absteigende Aorta anterior zur Wirbelsäule und sollte hier zusammen mit der Wirbelsäule geschnitten werden. Katheterisieren Sie die Aorta retrograd und drücken Sie den Katheter, bis er den Aortenbogen erreicht. Legen Sie mit einer Naht vier Stiche um die Aorta, beginnend fünf Millimeter unterhalb der Katheterspitze.
Schließen Sie die Maus über Silikonschläuche und untere Anschlüsse an ein Pumpensystem an. 15 Minuten lang mit entionisiertem Wasser bei 200 Mikrolitern pro Minute perfundieren. Wechseln Sie dann das Perfusionsmittel zu 0,5% DOC, verdünnen Sie es in deionisiertem Wasser und perfundieren Sie es über Nacht.
Wechseln Sie am nächsten Tag das Perfusionsmittel auf 0,1% SDS, verdünnt in entionisiertem Wasser, und perfundieren Sie es acht Stunden lang. Dann 24 Stunden lang mit deionisiertem Wasser perfundieren, um das SDS und DOC wegzuspülen. Resezieren Sie das dezellularisierte Herz und die Lunge, indem Sie seine Anhaftungen am Thorax schneiden.
Lagern Sie das Gewebe in einem sterilen Kryoröhrchen in deionisiertem Wasser mit 1% PenicillinStrptomycin und 0,3 mikromolarem Natriumazid bei vier Grad Celsius. Um eine Immunfärbung durchzuführen, blockieren Sie die Probe, indem Sie sie in einem Kryoröhrchen mit 6% Eselserum und 3% BSA über Nacht inkubieren. Dann mit primärem Antikörper in 3% Eselserum in PBS für 24 Stunden inkubieren.
Nach der Inkubation die Probe fünfmal in PBST für eine Stunde pro Wäsche waschen. Inkubieren Sie die Probe mit fluoreszierend konjugierten sekundären Antikörpern in 3% Eselserum in PBS für 24 Stunden. Wiederholen Sie dann die Wäschen in PBST.
Fügen Sie das ionisierte Wasser hinzu und lagern Sie die Probe bei vier Grad Celsius vor direktem Licht geschützt. Um die Probe abzubilden, legen Sie sie in eine Glasbodenschale und befeuchten Sie sie mit zwei Tröpfchen Lagerlösung. Stellen Sie das Objektiv ein und untersuchen Sie die Probe mit Fluoreszenzlicht.
Wechseln Sie zur Computersteuerung, schalten Sie Laser ein und passen Sie Laserintensität, Lochblende, Wellenlänge, Verstärkung, Auflösung und Zoom an. Legen Sie die Anzahl und Schrittweite für den Z-Stack fest und beginnen Sie dann mit der Erfassung. Schneiden Sie einen Lungenlappen aus einer eingeschläferten Maus heraus und legen Sie ihn in eine 10 x 10 x fünf Millimeter große Kryoform.
Bedecken Sie es mit etwa 500 Meilen Mikroliter OCT-Compound und frieren Sie es auf Trockeneis ein. Halten Sie die Probe auf dieser Temperatur. Schneiden Sie einen dezellularisierten Lungenlappen aus einer verarbeiteten Maus heraus, legen Sie ihn in eine Kryoform mit der größten Oberfläche nach unten und bedecken Sie ihn mit OCT-Verbindung.
Frieren Sie die Probe auf Trockeneis ein und halten Sie sie auf dieser Temperatur, bis dies anderweitig erforderlich ist. Die Probe kann mindestens 12 Wochen gelagert werden. Verwenden Sie einen Kryostaten, um gefrorene Gewebeblöcke bei minus 20 Grad Celsius in fünf Mikrometerabschnitte zu schneiden.
Und platzieren Sie die Abschnitte auf Glasklebeobjektträgern. Die Folien auf Raumtemperatur bringen, bis die Luft getrocknet ist. Tauchen Sie die Objektträger kurz in PBS ein, gefolgt von 4% Paraformaldehyd in PBS für 15 Minuten.
Einmal in PBS waschen, dann zweimal in destilliertem Wasser für fünf Minuten pro Waschgang. Tauchen Sie die Objektträger 10 Minuten lang in die Hämatoxylinlösung von Myer ein. Als nächstes waschen Sie die Objektträger in einem Copeland-Glas unter fließendem destilliertem Wasser für 10 Minuten und tauchen Sie sieben Minuten in Eosinlösung ein.
Mehrmals in Xylol tauchen. Tragen Sie ein paar Tropfen DPX-Montagemedium auf und legen Sie einen Glasabdeckungszettel auf. Lassen Sie die Dias über Nacht unter einer chemischen Haube trocknen und scannen Sie sie dann in einem Diascanner.
Nach erfolgreichem Abschluss des Protokolls sind Herz und Lunge sowie NX-Gewebe frei von Zellen. Die Dezellularisation kann durch Hämatoxylin-Eosin-Färbung der ECM-Gerüste validiert werden. Die Gerüste behalten die Abmessungen von frischen Organen bei und ihre unverträgliche ECM-Struktur ist intakt.
ECM-Gerüste zeigten eine erhöhte Durchlässigkeit und Lichtdurchdringbarkeit. Die Verwendung dieses Protokolls mit einem motorisierten Mikroskoptisch ermöglicht die dreidimensionale kachelte Abbildung ganzer Mount-Proben mit einer Auflösung im Submikrometerbereich. Es ist wichtig, den Fluss zu den interessierenden Organen zu meiden, um eine vollständige gleichmäßige Enteignung zu erreichen.
Die mikrochirurgische Dissektion und Ligatur von Gefäßen muss wirksam sein. Und respektieren Sie gleichzeitig die Zielgewebe, um die native VCM-Struktur aufrechtzuerhalten. Nach diesem Verfahren werden die Gerüste für strukturelle ECM-Proteine angereichert und können für die Massenspektrometrie oder das Tissue Engineering verwendet werden.
Diese Technik ebnet den Weg zur hochauflösenden Abbildung der extrazellulären Matrix.
