بدأ علماء الأحياء المجهرية وأطباء الأمراض المعدية يدركون مدى أهمية العدوى المرتبطة بالبيو فيلم في الأمراض المزمنة. حتى أن المعاهد القومية للصحة قالت إن أكثر من 80٪ من العدوى المزمنة ترجع إلى الأغشية الحيوية البكتيرية. لذلك حث هذا على التركيز على معالجة بيو فيلم ، وتطوير العلاجات التي تعالج مشكلة بيو فيلم.
وتركز الكثير من تلك العلاجات على تشتيت الخلايا البكتيرية الموجودة في الأغشية الحيوية من بيو فيلم بحيث يمكن قتلها بسهولة أكبر. ولكن في الحقيقة لا يوجد الكثير من البروتوكولات في الأدبيات التي تعالج حاليا كيفية تحديد فعالية مثل هذا العامل التشتت. لذلك نشعر أن هذا بروتوكول جيد للاستخدام.
إنه نوع واحد من العدوى البكتيرية المرتبطة بيو فيلم. ونعتقد أيضا أنه يمكن تحسينها بسهولة كبيرة لدراسة العديد من الأنواع المختلفة من الأنواع البكتيرية ، وكيف تشكل الأغشية الحيوية وتتفرق ، وكذلك عوامل التشتت المختلفة. ونعتقد أنه من المهم تقديم هذا في شكل فيديو ، لأننا رأينا أن هناك فروقا دقيقة خاصة في تسليم الوكيل الذي وجدناه يعمل على النحو الأمثل في الفئران.
للبدء، تقييم مستوى التخدير عن طريق قرصة إصبع القدم، ومراقبة معدل التنفس والجهد. حلق السطح الظهري وتطبيق كريم إزالة الشعر إلى منطقة حلق لمدة 10 دقائق، أو وفقا لتعليمات المنتج. إزالة بلطف كريم إزالة الشعر.
وتأكد من جفاف الجلد. باستخدام علامة مقاومة للكحول، ارسم دائرة قطرها 1.5 سنتيمتر نحو المنطقة الخلفية من الظهر. لإدارة الألم، وإدارة 0.05 ملليلتر من الليدوكائين تحت الجلد في المنطقة ليتم استئصالها.
و0.02 ملليلتر من البوبرينورفين تحت الجلد في سكروف الرقبة. انتظر 10 دقائق لضمان الوصول إلى إدارة الألم. قبل استئصال، تطهير السطح الظهري باستخدام مسحة الكحول.
الحفاظ على حقل جراحي معقم طوال العملية، واستخدام الأدوات الاوتوسلافية والقفازات العقيمة للحد من التلوث. إدارة كامل سمك الجرح الجلد استئصالي إلى مستوى العضلات panniculus، مع مقص الجراحية. بعد استئصال، تغطية الجرح فورا مع شبه نفاذية البولي يوريثين خلع الملابس.
فصل بعناية دعم من خلع الملابس باستخدام اثنين من ملقط غرامة يميل، إذا كان ذلك ممكنا. حقن ما يقرب من 10 إلى CFU الرابع من البكتيريا، و 100 ميكرولتر PBS تحت خلع الملابس وعلى سرير الجرح لإنشاء عدوى. ملاحظة، يمكن أيضا أن تكون مصابة الجروح مع أنواع متعددة من البكتيريا و / أو الفطريات في وقت واحد، أو عن طريق وضع الأغشية الحيوية مسبقة التشكيل أو حتى الأنسجة debridement المستخرجة من المرضى على سرير الجرح.
بعد العدوى، ضع الفئران في أقفاص فوق المناشف الورقية لمنع الفئران من الاختناق على مواد الفراش. وضع الأقفاص على منصات التدفئة ورصد الفئران حتى أنها استعادت منعكس الحق. إزالة منشفة ورقية في هذه المرحلة.
السماح لالتهابات الجروح بالثبات لمدة 48 ساعة. فحص خلع الملابس يوميا للدموع في مناطق عدم الاتساق واستبداله إذا لزم الأمر. وضع الفئران تحت التخدير isoflurane في 3٪ ولتر واحد في الدقيقة الواحدة من الأوكسجين، في حين إعطاء العلاجات.
حقن 200 ميكرولتر من محلول الإنزيم أو التحكم في PBS على الجرح عن طريق رفع الجلد الأمامي قليلا من الجرح مع ملقط، ثقب بعناية الجلد رفع مع الحقنة، وحقن ببطء الحل في المنطقة بين سرير الجرح وخلع الملابس. لضمان تغطية سرير الجرح بأكمله بالمحلول ، ارفع الضمادة برفق مع ملقط ، وسحبها بعيدا عن سرير الجرح ، مع حقن المحلول ببطء. بعد العلاج، ضع الفئران مرة أخرى في أقفاص لمدة 30 دقيقة.
بعد 30 دقيقة من التعرض للعلاج ، وإعادة تخدير الفئران مع isoflurane و أسبايرات الحل المتبقي مع حقنة ، ثقب في نفس المنطقة كما كان من قبل. لاحظ أن هذا المحلول المهتلأ يحتوي على خلايا بكتيرية مشتتة، والتي يمكن حفظها لمختلف التحليلات المصب. إدارة علاجات الري الثانية والثالثة كما تم القيام به لأول مرة باستخدام حقنة جديدة في كل مرة.
إذا تم استخدام سلالة من البكتيريا الإنارة لبدء العدوى، يمكن استخدام نظام تصوير في الجسم الحي لتصور التشتت من سرير الجرح. للتحليل، افتح الصور في برنامج IVIS وحدد المنطقة التي سيتم تحليلها باستخدام لوحة الأدوات. لحساب الخلفية، ضع دائرة على خلفية صورة، ثم ضع نفس الدائرة ذات الحجم فوق سرير الجرح لكل فأر.
من لوحة الأدوات، حدد قياس ROIs ثم قم بتحميل جدول القياسات إلى جدول بيانات. طرح قراءة دائرة الخلفية من كل من قياسات سرير الجرح لحساب التلألؤ لكل عينة. بعد القتل الرحيم الإنساني ، احصد أنسجة سرير الجرح عن طريق إزالة الضمادة أولا بلطف مع ملقط معقم ، والقطع حول محيط سرير الجرح بمقص جراحي معقم.
استخدم ملقط لرفع بلطف أحد طرفي سرير الجرح، ثم استخدم مقصا لقطع عينة الأنسجة بعيدا عن طبقة العضلات. ضع عينة الأنسجة في أنبوب تجانس زنته مسبقا ملليلترين يحتوي على ملليلتر واحد من PBS. وزن الأنبوب مرة أخرى بعد إدراج العينة.
لحصاد الطحال، ضع الماوس في وضع تشريحي ينم عن الأمان عن طريق تثبيت الأطراف على سطح تشريح. نقع المنطقة ليتم تشريحها مع 70٪ الإيثانول للمساعدة في منع التلوث. جعل شق صغير عمودي على خط الوسط مع مقص الجراحية في الأدمة من أسفل البطن.
تأكد من سحب الجلد صعودا وبعيدا عن الأعضاء الداخلية. استمر في الشق على طول خط الوسط حتى يتم الوصول إلى القص. بمجرد أن يتعرض التجويف البريتوني وتظهر الأعضاء الداخلية ، افصل الطحال عن النسيج الضام ووضع في أنبوب تجانس منفصل قبل الوزن.
وزن الأنبوب مرة أخرى بعد إدخال الطحال. تجانس العينات في خمسة أمتار في الثانية الواحدة، لمدة 60 ثانية، مرتين. تعداد CFU، مخففة بشكل متسلسل ولوحة بقعة عينات متجانسة.
تمييع المسلسل عن طريق الأنابيب 100 ميكرولتر من العينة المتجانسة إلى 900 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني وأنبوب طرد مركزي 1.5 ملليلتر. دوامة قبل مواصلة التخفيف عن طريق الأنابيب 100 ميكرولتر من العينة المخففة في أنبوب منفصل يحتوي على 900 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني. كرر هذه الخطوات حتى يتم تحقيق ستة تمييع.
ماصة 10 ميكرولتر من كل تخفيف على المنطقة المشار إليها على لوحة أجار كما هو مبين. إذا كان مطلوبا كمية CFU أكثر دقة، وانتشار 100 ميكرولتر من كل تخفيف العينة عبر لوحات أجار منفصلة. الجرح وإصابة الفئران مع ما يقرب من 10 إلى CFU الرابع من البكتيريا، كما هو موضح في بروتوكول في الجسم الحي.
السماح للعدوى لتحديد لمدة 48 ساعة، ثم استخراج سرير الجرح بطريقة مماثلة لبروتوكول في الجسم الحي. تبدأ عن طريق إزالة بعناية خلع الملابس. قطع محيط الجرح.
والانفصال عن طبقة العضلات. يمكن تقسيم عينة سرير الجرح إلى أقسام متعددة لزيادة عدد العينات. ثم ضع العينات المقسمة في أنابيب تجانس فارغة منفصلة قبل وزنها.
وزن الأنبوب مرة أخرى وحساب وزن العينة عن طريق طرح وزن الأنبوب دون عينة من وزن الأنبوب مع العينة. إضافة ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني إلى أنبوب التجانس التي تحتوي على العينة، وعكس بلطف أنبوب عدة مرات لشطف. إزالة غسل برنامج تلفزيوني وتجاهل.
إضافة ملليلتر واحد من العلاج GH، أو برنامج تلفزيوني كتحكم سلبي، واحتضان لمدة ساعتين في 37 درجة مئوية، مع اهتزاز في 80 دورة في الدقيقة. إزالة الصفراء من محلول التشتت ووضعها في أنبوب طرد مركزي منفصل 1.5 ملليلتر. هذا يحتوي على خلايا متفرقة.
غسل الأنسجة المتبقية مع ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني، كما فعلت سابقا، وتجاهل غسل برنامج تلفزيوني. إضافة ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني إلى الأنسجة المتبقية وتجانس في خمسة أمتار في الثانية الواحدة، لمدة 60 ثانية. تمييع كل من محلول الخلايا المشتتة وعينة الأنسجة المتجانسة عن طريق أنابيب 100 ميكرولتر من العينة إلى 900 ميكرولتر من PBS في أنبوب طرد مركزي 1.5 ملليلتر.
دوامة العينة المخففة ومواصلة التخفيف خمس مرات أخرى لما مجموعه ستة تمييع. لوحة بقعة العينة عن طريق الأنابيب 10 ميكرولتر من كل تخفيف على المنطقة المشار إليها على لوحة أجار انتقائية. عد CFU وحساب التشتت في المئة بقسمة CFU مشتتة على CFU مجموع، وضرب من قبل 100.
في هذه التجربة، أصيبت ثمانية إلى 10 أسابيع من الفئران السويسرية ويبستر القديمة مع 10 إلى CFU الرابع من PA01 تحمل البلازميد التلألؤ PQF50-لوكس. سمح للعدوى بتأسيس لمدة 48 ساعة قبل إدارة ثلاثة علاجات لمدة 30 دقيقة من برنامج تلفزيوني إما كتحكم في السيارة ، أو 10٪ GH كعلاج تجريبي لهضم EPS بيو فيلم. تم تصوير الفئران في القسم A قبل العلاج، مباشرة بعد العلاج، وفي 10 و 20 ساعة بعد العلاج.
باستخدام IVIS ، يمكن تصور عدوى ثابتة داخل سرير الجرح مما يولد إشارة مضيئة مضيئة. يمكن تصور تشتت البكتيريا من سرير الجرح مباشرة بعد علاج هرمون النمو ، ولكن ليس بعد علاج PBS. ويمكن أيضا أن ينظر إلى نشر البكتيريا في الأجهزة عن طريق وضع الماوس على جانبها للتصوير، كما هو مبين في الألواح السفلية.
في القسم B، أظهرت الصور من كل من برنامج تلفزيوني والفئران المعالجة GH زيادة في إشارة الإنارة في 20 ساعة بعد العلاج، مقارنة مع ما قبل العلاج. ومع ذلك، فإنه لا يزال من المهم لكمية CFU بسبب عتبة الكشف عن التلألؤ في IVIS. في 20 ساعة بعد العلاج، تم قتل الفئران بالرصاص وتم جمع أسرة الجرح والطحال لتعداد CFU لكل غرام من الأنسجة.
يظهر القسم ج الحمل البكتيري في سرير الجرح، في حين يظهر القسم D الحمل البكتيري في الطحال. وتشير هذه البيانات إلى انتشار البكتيريا المتناثرة، حيث لم يتم اكتشاف البكتيريا إلا في طحال الفئران المعالجة بمحلول هرمون النمو الذي يستهدف EPS. على الرغم من أن هذه البروتوكولات مفيدة جدا، هناك بعض القيود.
أولا ، تجدر الإشارة إلى أن هناك قصورا في الكشف مع نظام التصوير في الجسم الحي ، أو IVIS. ويمكن رؤية انخفاض في إشارة الإنارة عندما تدخل البكتيريا مرحلة ثابتة. ولذلك فمن المهم لجمع الأنسجة ذات الاهتمام وقياس CFU الحاضر، كما يمكن أن يكون هناك انقطاع بين التلألؤ وCFU تعدادها.
ومع ذلك ، فإن IVIS مفيد لتصور فعالية العلاج طوال الدراسة ، دون الحاجة إلى القتل الرحيم للحيوان. وثمة قيد آخر يجب مراعاته وهو اشتراط الرصد الدقيق للضمادات. الضمادات مطلوبة للحد من الشفاء الانكماشي وكذلك الحفاظ على الجرح معقمة من البكتيريا الأخرى.
وسيتعين استبدال الضمادات في كثير من الأحيان، مما قد يؤدي إلى إصابة الجرح عن طريق الخطأ وفرصة للتلوث. تصف هذه البروتوكولات أساليب جديدة لدراسة الصفراء من التشتت ، وتقييم الصفراء العلاجية من عوامل التشتت. تسمح هذه النماذج بتطوير العدوى المعقدة المرتبطة بالبيو فيلم متعدد الميكروبات التي تحاكي العدوى البشرية ذات الصلة سريريا.
ويحدونا الأمل في أن تستخدم هذه البروتوكولات وتصقلها لتعزيز تطوير عوامل تشتيت مكافحة الأغشية الحيوية للاستخدام العلاجي.
