微生物学家和传染病医生开始意识到与生物膜相关的感染在慢性疾病中的重要性。国家卫生研究院甚至说，超过80%的慢性感染是由于细菌生物膜。因此，这敦促强调解决生物膜问题，并开发治疗生物膜问题。
很多这些治疗方法都集中在将生物膜中的细菌细胞从生物膜中分离出来，以便它们更容易被杀死。但是，目前文献中确实没有很多协议可以讨论如何确定这种分散剂的功效。因此，我们觉得这是一个很好的协议使用。
它是一种与生物膜相关的细菌感染。我们还认为，研究许多不同类型的细菌物种，以及它们如何形成生物膜和分散，以及不同的分散剂，可以很容易地进行优化。我们认为以视频格式提供这一点很重要，因为我们已经看到，有细微差别，特别是代理的交付，我们已经找到了最好的工作在小鼠。
首先，通过脚趾捏，并通过监测呼吸速率和努力来评估麻醉平面。剃须后表面，在剃须区域涂抹脱毛霜10分钟，或按照产品的说明。轻轻取出脱脂霜。
并确保皮肤干燥。使用防酒精标记，在背面后部区域画一个直径为 1.5 厘米的圆圈。对于疼痛管理，将 0.05 毫升利多卡因皮下部管理到要切除的区域。
和 0.02 毫升丁丙诺啡皮下在脖子的擦伤。等待10分钟，以确保疼痛管理达到。切口前，使用酒精拭子对后部表面进行消毒。
在整个手术过程中保持无菌手术场，并使用高压仪器和无菌手套来限制污染。用手术剪刀将全厚切口皮肤伤口施用到泛尼库鲁斯肌肉的水平。切除后，立即用半透气聚氨酯敷料盖住伤口。
如果适用，使用两个细尖钳小心地将衬里与敷料分开。将大约10个细菌注射到第四个CFU，在敷料下和伤口床上注射100微升PBS，以建立感染。请注意，伤口也可以同时感染多种细菌和/或真菌，或将预先成形的生物膜，甚至从患者身上提取的脱行组织放在伤口床上。
感染后，将小鼠放在纸巾上的笼子里，以防止小鼠在床上用品上窒息。将笼子放在加热垫上，监视小鼠，直到它们恢复右反射。此时取下纸巾。
允许伤口感染建立48小时。每天检查敷料是否在不连续区域出现撕裂，如果需要，则更换。将小鼠置于异氟烷麻醉下，每分钟氧气3%和1升，同时进行治疗。
将200微升酶溶液或PBS控制液注射到伤口上，用钳子抬起伤口稍稍前部的皮肤，用注射器小心地刺穿抬起的皮肤，然后慢慢将溶液注射到伤口床和敷料之间的区域。为了确保整个病床被溶液覆盖，用钳子轻轻抬起敷料，将其从病床上拉开，同时慢慢注射溶液。治疗后，将老鼠放回笼子里30分钟。
在接触治疗30分钟后，用异氟兰重新麻醉小鼠，用注射器吸气剩余的溶液，与以前在同一区域穿刺。请注意，此吸气溶液包含分散的细菌细胞，可用于各种下游分析。像第一次一样，每次使用新的注射器进行第二次和第三次灌溉处理。
如果利用发光菌株引发感染，则可以使用活体成像系统可视化伤口的分散。要进行分析，请打开 IVIS 软件中的图像，并选择要使用工具调色板分析的区域。为了说明背景，在图像的背景上放置一个圆圈，然后为每只鼠标在伤口床顶部放置相同大小的圆圈。
从工具调色板中，选择测量 ROI 并将测量表上传到电子表格。从每个伤口床测量中减去背景圆读数，以计算每个样本的发光度。人道安乐死后，首先用无菌钳子轻轻取出敷料，用无菌手术剪刀在伤口床周围切割，收获伤口床组织。
使用钳子轻轻抬起伤口床的一端，然后用剪刀将组织样本从肌肉层切开。将组织样本放在一个预称的两毫升同质化管中，其中含有一毫升PBS。插入样品后再次称重管子。
要收获脾脏，将鼠标置于超精解剖位置，并将四肢固定在解剖表面，从而固定安全。用70%乙醇浸泡该地区，以帮助防止污染。用手术剪刀在下腹部的真皮上做一个小切口垂直于中线。
确保将皮肤向上拉起，远离内脏。沿着中线继续切口，直到达到胸骨。一旦腹膜腔暴露，内部器官可见，将脾脏从结缔组织中分离出来，并放置在单独的预称量均质管中。
插入脾脏后再次称重管子。以每秒5米的速度对样品进行同质化，60秒，两次。要列举 CFU，应连续稀释并点板均匀化样品。
通过将同质化样品的 100 微升管道输送到 900 微升 PBS 和 1.5 毫升离心机管中，连续稀释。在继续稀释之前，将稀释样品的 100 微升管道输送到包含 900 微升 PBS 的单独管中。重复这些步骤，直到实现六次稀释。
Pipette 10 微升，每个稀释到阿加板上的指示区域，如图所示。如果需要更精确的 CFU 量度，则将样品的每次稀释的 100 微升分布在单独的 agar 板上。伤口和感染小鼠约10至第四CFU的细菌，如体内协议所述。
允许感染建立48小时，然后以类似体内协议的方式提取伤口床。首先小心地取出敷料。绕伤口周界切割。
和从肌肉层分离。病床样本可分为多个部分，以增加样本数量。然后将分离的样品放入单独的预称空同质化管中。
再次称重管，并通过从样品的管的重量中减去没有样品的管子重量来计算样品的重量。将一毫升 PBS 添加到包含样品的同质化管中，然后轻轻倒置管数次进行冲洗。删除 PBS 洗涤并丢弃。
加入一毫升GH处理，或PBS作为负控制，在37摄氏度下孵育两小时，在80 RPM下摇晃。从分散溶液中取出胆汁，放在单独的 1.5 毫升离心管中。这包含分散的细胞。
像以前一样，用一毫升 PBS 清洗剩余的组织，然后丢弃 PBS 洗涤。在剩余组织中加入一毫升 PBS，以每秒 5 米的速度均质，时间为 60 秒。通过在1.5毫升离心管中将样品中的100微升输送到900微升PBS中，连续稀释分散细胞的溶液和同质化组织样本。
对稀释后的样品进行涡流，并继续稀释五次，总共进行六次稀释。通过将每个稀释的 10 微升管道输送到选择性 agar 板上的指示区域来发现样品板。计算 CFU 并计算百分比分散，将分散的 CFU 除以总 CFU，乘以 100。
在这个实验中，8到10周大的瑞士雌性韦伯斯特小鼠感染了携带发光质粒PQF50-lux的PA01的10到第四个CFU。感染允许建立48小时之前管理三个30分钟的治疗PBS作为车辆控制，或10%GH作为实验性治疗消化生物膜EPS。在A节中显示，小鼠在治疗后直接在10小时和20小时进行影像治疗。
使用 IVIS，可以在伤口床内可视化已建立的感染，从而产生明亮的生物发光信号。GH 治疗后，可以立即将细菌从伤口床上分散出来，但在 PBS 治疗后无法可视化。细菌传播到器官也可以看到，通过放置鼠标在其侧面成像，如在下面板显示。
在B节中，PBS和GH治疗小鼠的图像显示，与治疗前相比，治疗后20小时发光信号增加。但是，由于 IVIS 中的发光检测阈值，因此量化 CFU 仍然很重要。治疗后20小时，老鼠被安乐死，伤口床和脾脏被收集起来，列举每克组织CFU。
C节显示伤口床上的细菌负荷，而D节显示脾脏中的细菌负荷。这些数据表明分散的细菌传播，因为细菌只在用EPS靶向GH溶液治疗的小鼠的脾脏中检测到。虽然这些协议非常有用，但也有一些限制。
首先，应该指出，体内成像系统（IVIS）存在检测限制。当细菌进入静止阶段时，可以看到发光信号的减少。因此，收集感兴趣的组织并测量CFU存在很重要，因为发光和CFU之间可能存在脱节。
然而，IVIS在整个研究中有助于可视化治疗的功效，而不必实际对动物实施安乐死。另一个需要考虑的限制是需要密切监测绷带。绷带需要减少收缩愈合，并保持伤口不育从其他细菌。
绷带需要经常更换，这可能导致意外的伤口脱口而出和污染的机会。这些协议描述了研究分散胆汁的新方法，以及从分散剂中评估治疗胆汁的方法。这些模型允许开发复杂的多微生物生物膜相关感染，模仿临床相关的人类感染。
我们希望，这些协议将得到利用和完善，以进一步推动抗生物膜分散剂的治疗用途的发展。
