Mikrobiologen und Ärzte für Infektionskrankheiten beginnen zu erkennen, wie wichtig Biofilm-assoziierte Infektionen bei chronischen Erkrankungen sind. Das NIH hat sogar gesagt, dass über 80% der chronischen Infektionen auf bakterielle Biofilme zurückzuführen sind. Dies hat also den Schwerpunkt auf die Behandlung von Biofilm und die Entwicklung von Therapeutika gelegt, die das Biofilmproblem angehen.
Und eine Lotta diese Therapeutika konzentrieren sich darauf, Bakterienzellen, die sich in Biofilmen befinden, aus dem Biofilm zu dispergieren, so dass sie leichter abgetötet werden können. Aber es gibt derzeit wirklich nicht viele Protokolle in der Literatur, die sich damit befassen, wie man die Wirksamkeit eines solchen Dispersionsmittels bestimmen kann. Wir haben also das Gefühl, dass dies ein gutes Protokoll ist.
Es ist eine Art von bakterieller Infektion, die biofilm-assoziiert ist. Und wir denken auch, dass es ziemlich einfach optimiert werden kann, viele verschiedene Arten von Bakterienarten zu untersuchen und wie sie Biofilme bilden und sich ausbreiten, sowie verschiedene Dispersionsmittel. Und wir denken, dass es wichtig ist, dies in einem Videoformat zu liefern, weil wir gesehen haben, dass es Nuancen gibt, insbesondere bei der Lieferung des Agenten, den wir bei Mäusen optimal gefunden haben.
Um zu beginnen, beurteilen Sie die Ebene der Anästhesie durch Zehenklemme und durch Überwachung der Atemfrequenz und Anstrengung. Rasieren Sie die dorsale Oberfläche und tragen Sie eine Enthaarungscreme für 10 Minuten oder gemäß den Anweisungen des Produkts auf die rasierte Region auf. Entfernen Sie vorsichtig die Enthaarungscreme.
Und stellen Sie sicher, dass die Haut trocken ist. Zeichnen Sie mit einem alkoholbeständigen Marker einen Kreis mit einem Durchmesser von 1,5 Zentimetern in Richtung des hinteren Bereichs des Rückens. Zur Schmerzbehandlung 0,05 Milliliter Lidocain subkutan in den zu entfernenden Bereich verabreichen.
Und 0,02 Milliliter Buprenorphin subkutan im Hals. Warten Sie 10 Minuten, um sicherzustellen, dass die Schmerzbehandlung erreicht wird. Vor der Exzision die dorsale Oberfläche mit einem Alkoholtupfer desinfizieren.
Halten Sie während des gesamten Eingriffs ein steriles Operationsfeld aufrecht und verwenden Sie autoklavierte Instrumente und sterile Handschuhe, um die Kontamination zu begrenzen. Verabreichen Sie eine Exzisionshautwunde in voller Dicke auf Höhe des Panniculus-Muskels mit einer chirurgischen Schere. Nach der Exzision die Wunde sofort mit einem semipermeablen Polyurethanverband abdecken.
Trennen Sie den Träger vorsichtig vom Verband mit zwei feinspitzigen Zetten, falls zutreffend. Injizieren Sie etwa 10 bis die vierte KBE von Bakterien und 100 Mikroliter PBS unter den Verband und auf das Wundbett, um eine Infektion zu etablieren. Beachten Sie, dass Wunden auch mit mehreren Bakterienarten und / oder Pilzen gleichzeitig infiziert werden können oder indem vorgeformte Biofilme oder sogar Debridementgewebe, das von Patienten extrahiert wurde, auf das Wundbett gelegt werden.
Legen Sie mäuse nach der Infektion in Käfige auf Papiertücher, um zu verhindern, dass die Mäuse auf dem Bettmaterial ersticken. Legen Sie die Käfige auf Heizkissen und überwachen Sie die Mäuse, bis sie ihren Aufrändungsreflex wiedererlangt haben. Entfernen Sie an dieser Stelle das Papiertuch.
Lassen Sie Wundinfektionen für 48 Stunden etablieren. Untersuchen Sie den Verband täglich auf Risse in Bereichen, in denen es nicht haftend ist, und ersetzen Sie ihn bei Bedarf. Setzen Sie Mäuse unter Isoflurananästhesie bei 3% und einem Liter Sauerstoff pro Minute, während Sie Behandlungen verabreichen.
Injizieren Sie 200 Mikroliter Enzymlösung oder PBS-Kontrolle auf die Wunde, indem Sie die Haut leicht vor der Wunde mit einer Zette anheben, die angehobene Haut vorsichtig mit der Spritze durchbohren und die Lösung langsam in den Bereich zwischen dem Wundbett und dem Verband injizieren. Um sicherzustellen, dass das gesamte Wundbett mit Lösung bedeckt ist, heben Sie den Verband vorsichtig mit einer Zette an, ziehen Sie ihn vom Wundbett weg, während Sie die Lösung langsam injizieren. Nach der Behandlung legen Sie die Mäuse für 30 Minuten wieder in Käfige.
Nach 30 Minuten Exposition gegenüber der Behandlung reanesthetisieren Sie die Mäuse mit Isofluran und saugen die verbleibende Lösung mit einer Spritze an, wobei Sie in der gleichen Stelle wie zuvor punktieren. Beachten Sie, dass diese Aspirierte Lösung dispergierte Bakterienzellen enthält, die für verschiedene nachgeschaltete Analysen gespeichert werden können. Verabreichen Sie die zweite und dritte Bewässerungsbehandlung wie bei der ersten mit einer neuen Spritze jedes Mal.
Wenn ein lumineszierender Bakterienstamm verwendet wird, um eine Infektion auszulösen, kann ein In-vivo-Bildgebungssystem verwendet werden, um die Ausbreitung aus dem Wundbett zu visualisieren. Zur Analyse öffnen Sie die Bilder in der IVIS-Software und wählen mit der Werkzeugpalette den zu analysierenden Bereich aus. Um den Hintergrund zu berücksichtigen, platzieren Sie einen Kreis auf dem Hintergrund eines Bildes und platzieren Sie dann den kreisigen Kreis der gleichen Größe auf dem Wundbett für jede Maus.
Wählen Sie in der Werkzeugpalette die Option MEASURE ROIs aus, und laden Sie die Messtabelle in eine Tabelle hoch. Subtrahieren Sie den Hintergrundkreiswert von jeder der Wundbettmessungen, um die Lumineszenz für jede Probe zu berechnen. Nach der humanen Euthanasie ernten Sie das Wundbettgewebe, indem Sie zuerst den Verband mit einer sterilen Zette vorsichtig entfernen und mit einer sterilen chirurgischen Schere um den Umfang des Wundbettes schneiden.
Verwenden Sie eine Zette, um ein Ende des Wundbettes sanft anzuheben, und schneiden Sie dann mit einer Schere die Gewebeprobe von der Muskelschicht ab. Legen Sie die Gewebeprobe in ein vorgewogenes Zwei-Milliliter-Homogenisierungsröhrchen, das einen Milliliter PBS enthält. Wiegen Sie das Röhrchen nach dem Einsetzen der Probe erneut.
Um die Milz zu ernten, legen Sie die Maus in eine anatomische Rückenlage und sichern Sie sie, indem Sie die Extremitäten an eine Sezieroberfläche heften. Weichen Sie den zu sezierenden Bereich mit 70% Ethanol ein, um eine Kontamination zu vermeiden. Machen Sie einen kleinen Schnitt senkrecht zur Mittellinie mit einer chirurgischen Schere in der Dermis des Unterbauchs.
Stellen Sie sicher, dass Sie die Haut von den inneren Organen nach oben und weg ziehen. Setzen Sie den Schnitt entlang der Mittellinie fort, bis das Brustbein erreicht ist. Sobald die Peritonealhöhle freigelegt ist und die inneren Organe sichtbar sind, trennen Sie die Milz vom Bindegewebe und legen Sie sie in ein separates vorgewogenes Homogenisierungsröhrchen.
Wiegen Sie den Schlauch nach dem Einsetzen der Milz erneut. Homogenisieren Sie die Proben mit fünf Metern pro Sekunde, für 60 Sekunden, zweimal. Um die KBE aufzuzählen, verdünnen Sie die homogenisierten Proben seriell und punktieren Sie sie.
100 Mikroliter der homogenisierten Probe werden durch Pipettieren in 900 Mikroliter PBS und ein 1,5-Milliliter-Zentrifugenröhrchen seriell verdünnt. Wirbel vor der Fortsetzung der Verdünnung durch Pipettieren von 100 Mikrolitern der verdünnten Probe in ein separates Röhrchen mit 900 Mikrolitern PBS. Wiederholen Sie diese Schritte, bis sechs Verdünnungen erreicht sind.
Pipetten Sie 10 Mikroliter jeder Verdünnung auf die angegebene Fläche auf einer Agarplatte wie gezeigt. Wenn eine genauere CFU-Quantifizierung erforderlich ist, verteilen Sie 100 Mikroliter jeder Verdünnung der Probe auf separate Agarplatten. Verwundete und infizieren Mäuse mit etwa 10 bis zur vierten KBE von Bakterien, wie im In-vivo-Protokoll beschrieben.
Lassen Sie die Infektion für 48 Stunden etablieren und extrahieren Sie dann das Wundbett auf ähnliche Weise wie das In-vivo-Protokoll. Beginnen Sie, indem Sie den Verband vorsichtig entfernen. Schneiden um den Umfang der Wunde.
Und sich von der Muskelschicht trennen. Die Wundbettprobe kann in mehrere Abschnitte unterteilt werden, um die Anzahl der Proben zu erhöhen. Anschließend legen Sie die geteilten Proben in separate vorgewogene leere Homogenisierungsröhrchen.
Wiegen Sie das Röhrchen erneut und berechnen Sie das Gewicht der Probe, indem Sie das Gewicht des Röhrchens ohne die Probe vom Gewicht des Röhrchens mit der Probe abziehen. Fügen Sie ein Milliliter PBS in das Homogenisierungsröhrchen mit der Probe hinzu und kehren Sie das Röhrchen einige Male vorsichtig um, um es zu spülen. PbS-Waschung entfernen und entsorgen.
Fügen Sie einen Milliliter GH-Behandlung oder PBS als Negativkontrolle hinzu und inkubieren Sie zwei Stunden bei 37 Grad Celsius mit Schütteln bei 80 U / min. Entfernen Sie die Galle aus der Ausbreitungslösung und legen Sie sie in ein separates 1,5-Milliliter-Zentrifugenröhrchen. Diese enthält die dispergierten Zellen.
Waschen Sie das verbleibende Gewebe wie zuvor mit einem Milliliter PBS und entsorgen Sie die PBS-Wäsche. Fügen Sie dem verbleibenden Gewebe einen Milliliter PBS hinzu und homogenisieren Sie mit fünf Metern pro Sekunde für 60 Sekunden. Verdünnen Sie sowohl die Lösung der dispergierten Zellen als auch die homogenisierte Gewebeprobe seriell, indem Sie 100 Mikroliter der Probe in einem 1,5-Milliliter-Zentrifugenröhrchen in 900 Mikroliter PBS pipettieren.
Wirbeln Sie die verdünnte Probe vor und setzen Sie die Verdünnung fünf weitere Male für insgesamt sechs Verdünnungen fort. Spotplatte der Probe durch Pipettieren von 10 Mikrolitern jeder Verdünnung auf die angegebene Fläche auf einer selektiven Agarplatte. Zählen Sie die KBE und berechnen Sie die prozentuale Verteilung, indem Sie die dispergierte KBE durch die gesamte KBE dividieren und mit 100 multiplizieren.
In diesem Experiment wurden acht bis 10 Wochen alte weibliche Schweizer Webster-Mäuse mit 10 bis der vierten CFU von PA01 infiziert, die das Lumineszenzplasmid PQF50-lux trugen. Die Infektion durfte sich 48 Stunden lang etablieren, bevor drei 30-minütige Behandlungen entweder PBS als Vehikelkontrolle oder 10% GH als experimentelle Behandlung zur Verdauung des Biofilm-EPS verabreichen. In Abschnitt A wurden Mäuse vor der Behandlung, direkt nach der Behandlung und 10 und 20 Stunden nach der Behandlung abgebildet.
Mit IVIS kann eine etablierte Infektion im Wundbett visualisiert werden, wodurch ein helles biolumineszierendes Signal erzeugt wird. Die Ausbreitung von Bakterien aus dem Wundbett kann unmittelbar nach der GH-Behandlung, nicht aber nach der PBS-Behandlung visualisiert werden. Die bakterielle Ausbreitung in die Organe kann auch beobachtet werden, indem die Maus zur Bildgebung auf die Seite gelegt wird, wie in den unteren Tafeln gezeigt.
In Abschnitt B zeigten Bilder sowohl von pbS- als auch von GH-behandelten Mäusen einen Anstieg des Lumineszenzsignals nach 20 Stunden nach der Behandlung im Vergleich zur Vorbehandlung. Aufgrund der Nachweisschwelle einer Lumineszenz in IVIS ist es jedoch immer noch wichtig, die CFU zu quantifizieren. Nach 20 Stunden nach der Behandlung wurden die Mäuse eingeschläfert und die Wundbetten und Milz wurden gesammelt, um die CFU pro Gramm Gewebe aufzuzählen.
Abschnitt C zeigt die Bakterienbelastung im Wundbett, während Abschnitt D die Bakterienbelastung in der Milz zeigt. Diese Daten deuten auf eine disseminierte Ausbreitung der dispergierten Bakterien hin, da Bakterien nur in der Milz der Mäuse nachgewiesen wurden, die mit der EPS-zielgerichteten GH-Lösung behandelt wurden. Obwohl diese Protokolle sehr nützlich sind, gibt es einige Einschränkungen.
Zunächst ist zu beachten, dass es eine Nachweisbeschränkung mit dem In-vivo-Bildgebungssystem oder IVIS gibt. Eine Abnahme des Leuchtsignals kann beobachtet werden, wenn die Bakterien in die stationäre Phase eintreten. Daher ist es wichtig, interessantes Gewebe zu sammeln und die vorhandene KBE zu messen, da es zu einer Trennung zwischen der Lumineszenz und der aufgezählten KBE kommen kann.
IVIS ist jedoch nützlich, um die Wirksamkeit der Behandlung während einer Studie zu visualisieren, ohne das Tier tatsächlich einschläfern zu müssen. Eine weitere zu berücksichtigenden Einschränkung ist die Anforderung einer genauen Überwachung der Bandagen. Die Bandagen werden benötigt, um die kontraktile Heilung zu reduzieren und die Wunde von anderen Bakterien steril zu halten.
Bandagen müssen häufig ausgetauscht werden, was zu einem versehentlichen Debridement der Wunde und der Möglichkeit einer Kontamination führen kann. Diese Protokolle beschreiben neuartige Methoden zur Untersuchung von Galle aus der Ausbreitung und die Bewertung von therapeutischer Galle aus Dispersionsmitteln. Diese Modelle ermöglichen die Entwicklung komplexer polymikrobieller Biofilm-assoziierter Infektionen, die klinisch relevante Infektionen beim Menschen nachahmen.
Wir hoffen, dass diese Protokolle genutzt und verfeinert werden, um die Entwicklung von Anti-Biofilm-Ausbreitungsmitteln für therapeutische Zwecke voranzutreiben.
