微生物学者や感染症の医師は、慢性疾患におけるバイオフィルム関連感染症がいかに重要であるかを認識し始めています。NIHは、慢性感染症の80%以上が細菌バイオフィルムによるものだとさえ述べています。そこで、バイオフィルムへの取り組みや、バイオフィルム問題に対処する治療薬の開発に重点を置くよう促しています。
そして、これらの治療薬は、バイオフィルムからバイオフィルム中にある細菌細胞をより容易に殺すことができるように分散させることに焦点を当てています。しかし、このような分散剤の有効性を決定する方法を取り上げるために現在の文献には、実際に多くのプロトコルはありません。だから、私たちはこれが使用する良いプロトコルであると感じています。
これは、バイオフィルムに関連する細菌感染の一種です。また、多くの異なる種類の細菌種を研究し、バイオフィルムを形成し、分散する方法、および異なる分散剤を研究することは非常に簡単に最適化できると考えています。そして、私たちは、特にマウスで最適に仕事を見つけたエージェントの配信にニュアンスがあることを見てきたので、ビデオ形式でこれを提供することが重要だと思います。
まず、つま先ピンチで麻酔の平面を評価し、呼吸数と労力を監視します。後ろ面を剃り、剃った領域に脱毛クリームを10分間、または製品の指示に従って塗布します。脱毛クリームをそっと取り除きます。
そして、皮膚が乾燥していることを確認してください。アルコール防止マーカーを使用して、背中の後部領域に向かって直径1.5センチメートルの円を描きます。疼痛管理のために、切除される領域に皮下に0.05ミリリットルのリドカインを投与する。
そして、首の擦り傷の中で皮下にブプレノルフィンの0.02ミリリットル。痛みの管理に到達するために10分待ちます。切除前に、アルコール綿棒を使用して後面を消毒する。
手順全体を通して無菌の外科分野を維持し、汚染を制限するためにオートクレーブされた器械および無菌手袋を使用する。外科用はさみで、皮膚の傷をパンニクル筋のレベルまで完全な厚さの皮膚を投与する。切除後、すぐに半透過性のポリウレタンドレッシングで創傷を覆う。
必要に応じて、2つの細かい鉗子を使用してドレッシングから慎重にバッキングを分離します。細菌の第4のCFUに約10を注入し、100マイクロリットルのPBSをドレッシングの下に注入し、創傷床に感染を確立する。注意:創傷はまた、複数の種の細菌および/または真菌に同時に感染すること、または患者から抽出されたプレフォームバイオフィルムまたは脱花組織を創傷床に置くことによっても感染することができる。
感染後、マウスが寝具に窒息するのを防ぐために、ペーパータオルの上のケージにマウスを置きます。ケージを加熱パッドに置き、マウスが正しい反射を取り戻すまで監視します。この時点でペーパータオルを取り外します。
創傷感染を48時間確立可能にする。不遵守の領域で涙のために毎日ドレッシングを検査し、必要に応じてそれを交換してください。マウスをイオブルラン麻酔下に3%、1リットルの酸素で配置し、治療を行う。
200マイクロリットルの酵素溶液またはPBSコントロールを、鉗子で創傷の皮膚をわずかに前に持ち上げ、持ち上げられた皮膚を注射器で慎重に突き刺し、創傷床とドレッシングの間の領域にゆっくりと溶液を注入することによって創傷に注入する。創傷床全体が溶液で覆われていることを確実にするために、ドレッシングを鉗子でそっと上げ、創傷床から引き離し、ゆっくりと溶液を注入する。治療後、マウスをケージに30分間戻します。
治療に30分曝露した後、マウスをイオブルランで再麻酔し、残りの溶液を注射器で吸引し、以前と同じ領域で穿刺する。なお、この吸引溶液は分散した細菌細胞を含み、様々な下流解析のために保存することができる。毎回新しい注射器を使用して最初に行われたように第二および第三の灌漑治療を投与する。
細菌の発光株が感染を開始するために利用される場合、インビボイメージングシステムを使用して創傷床からの分散を可視化することができる。解析のために、IVIS ソフトウェアでイメージを開き、ツール パレットで解析する領域を選択します。背景を説明するには、画像の背景に円を配置し、各マウスの傷床の上に同じサイズの円を配置します。
ツール パレットで[ROI を測定]を選択し、測定値のテーブルをスプレッドシートにアップロードします。各創傷床測定値から背景円の読み取りを引き、各サンプルの発光を計算します。人道的安楽死後、最初に無菌鉗子でドレッシングをそっと取り除き、滅菌手術用ハサミで創傷床の周囲を切断することによって創傷床組織を収穫する。
鉗子を使用して傷床の一方の端をそっと持ち上げ、ハサミを使って組織サンプルを筋肉層から切り離します。PBSの1ミリリットルを含む計量済みの2ミリリットル均質化チューブに組織サンプルを入れる。サンプルを挿入した後、チューブの重量をもう一度量ります。
脾臓を収穫するには、マウスをサピン解剖学的位置に置き、四肢を解剖表面に固定して固定します。汚染を防ぐために70%エタノールで解剖する領域を浸してください。下腹部の真皮に外科的なはさみで中線に垂直な小さな切開を行います.
皮膚を内臓から引き上げ、離してください。胸骨に達するまで、正中線に沿って切開を続けます。腹腔が露出し、内臓が見えるようになったら、脾臓を結合組織から分離し、別の計量済みの均質化チューブに入れる。
脾臓を挿入した後、チューブの重量を再測定します。サンプルを毎秒5メートル、60秒間、2回均質化します。CFUを列挙するために、ホモジナイズサンプルを連続して希釈し、スポットプレートを付ける。
900マイクロリットルのPBSと1.5ミリリットルの遠心分離管に均質化されたサンプルの100マイクロリットルをピペット化することによって連続的に希釈する。渦は、希釈したサンプルの100マイクロリットルをPBSの900マイクロリットルを含む別のチューブにピペット処理することによって希釈を継続する前に。6つの希釈が達成されるまで、これらのステップを繰り返します。
図示のように、各希釈液のピペット10マイクロリットルを寒天板上の示された領域に上に置く。より正確なCFU定量が必要な場合は、サンプルの各希釈液の100マイクロリットルを別々の寒天プレートに広げます。インビボプロトコルに記載されているように、細菌の約10〜第4のCFUを有するマウスを創傷および感染させる。
感染を48時間確立させ、インビボプロトコルと同様の方法で創傷床を抽出する。まず、ドレッシングを慎重に取り除きます。傷の周囲を切断します。
そして、筋肉層から分離する。創傷床試料は、サンプル数を増やすために複数のセクションに分割することができます。次に、分割したサンプルを別々の計量空の均質化チューブに入れます。
チューブを再び計量し、サンプルとチューブの重量からサンプルの重量を差し引くことでサンプルの重量を計算します。サンプルを含む均質化チューブにPBSを1ミリリットル加え、チューブを数回軽く反転してすすいでください。PBSを取り除き、廃棄します。
GH治療の1ミリリットル、または陰性対照としてPBSを加え、摂氏37度で2時間インキュベートし、80RPMで振る。分散液から胆汁を取り除き、別の1.5ミリリットル遠心管に入れる。これは、分散した細胞が含まれています。
残りの組織をPBSの1ミリリットルで洗浄し、先に行ったように、PBS洗浄を廃棄します。残りの組織にPBSの1ミリリットルを加え、毎秒5メートル、60秒間均質化します。1.5ミリリットルの遠心チューブで900マイクロリットルのPBSにサンプル100マイクロリットルをピペット処理することにより、分散した細胞の溶液と均質化された組織サンプルの両方を連続的に希釈します。
希釈したサンプルをボルテックスし、合計6つの希釈のためにさらに5回希釈を続ける。スポットプレートは、各希釈液の10マイクロリットルを選択的寒天板上の示された領域にピペット化することによって試料をプレートする。CFU を数え、分散した CFU を合計 CFU で除算し、100 を掛けて分散率を計算します。
この実験では、8〜10週齢のスイスウェブスターマウスが、PQF50-ルクスの発光プラスミドを運ぶPA01の10〜4番目のCFUに感染した。この感染は、車両制御としてPBSの3つの30分間の治療を管理する前に48時間、またはバイオフィルムEPSを消化する実験的治療として10%GHを確立することを許可した。A節に示すように、マウスは、治療前、治療直後、および治療後10時間及び20時間で画像化した。
IVISを用いて、創傷床内で確立された感染を可視化し、明るい生物発光シグナルを生成することができる。創傷床から細菌の分散は、GH処理後すぐに可視化することができますが、PBS処理後には可視化されません。下部パネルに示すように、マウスを画像化のためにその側に置くことによって、器官への細菌の播体の普及も見られる。
セクションBでは、PBSおよびGH処置マウスの両方からの画像は、前処理と比較して、治療後20時間で発光シグナルの増加を示した。しかし、光の検出閾値がIVISで検出するため、CFUを定量することは依然として重要です。治療後20時間で、マウスを安楽死させ、創傷ベッドと脾臓を採取し、組織の1グラム当たりCFUを列挙した。
セクションCは創傷床における細菌負荷を示し、一方、セクションDは脾臓における細菌負荷を示す。これらのデータは、EPS標的GH溶液で処理されたマウスの脾臓において細菌が検出されただけであるため、分散細菌の広がりを広めることが示唆される。これらのプロトコルは非常に便利ですが、いくつかの制限があります。
まず、インビボ撮像システム、またはIVISとの検出制限があることに留意すべきである。細菌が静止期に入ると発光シグナルの減少が見られます。したがって、発光とCFU列挙との間に切断が存在する可能性があるため、関心のある組織を収集し、存在するCFUを測定することが重要である。
しかし、IVISは、実際に動物を安楽死させることなく、研究全体を通して治療の有効性を視覚化するのに有用である。考慮すべきもう一つの制限は包帯の綿密な監視の要件である。包帯は、収縮治癒を減らすだけでなく、他の細菌から無菌の創傷を維持するために必要とされる。
包帯は頻繁に交換する必要があり、創傷の偶発的な脱ブリードメントや汚染の機会につながる可能性があります。これらのプロトコルは、分散から胆汁を研究する新規の方法、および分散剤からの治療胆汁の評価を記述する。これらのモデルは臨床関連の人間の伝染を模倣する複雑な多微生物バイオフィルム関連の伝染の開発を可能にする。
私たちの希望は、これらのプロトコルが使用され、治療用の抗バイオフィルム分散剤の開発をさらに進めるために精製されることを望んでいます。
