הערכת פיזור ביופילם בפצעי מורין

מיקרוביולוגים ורופאים למחלות זיהומיות מתחילים להבין עד כמה חשובים זיהומים הקשורים לביופילם במחלות כרוניות. NIH אפילו אמר כי מעל 80% של זיהומים כרוניים נובעים biofilms חיידקי. אז זה דחק בדגש על טיפול בביופילם, ופיתוח טיפולים המטפלים בבעיית הביופילם.

והרבה טיפולים אלה מתמקדים בפיזור תאים חיידקיים שנמצאים בביופילמים מתוך הביופילם, כך שהם יכולים להיהרג בקלות רבה יותר. אבל באמת אין הרבה פרוטוקולים בספרות כרגע שמטפלים כיצד לקבוע את היעילות של סוכן פיזור כזה. אז אנחנו מרגישים שזה פרוטוקול טוב לשימוש.

זהו סוג אחד של זיהום חיידקי הקשור לביופילם. ואנחנו גם חושבים שזה יכול להיות אופטימיזציה די בקלות ללמוד סוגים רבים ושונים של מינים חיידקיים, וכיצד הם יוצרים biofilms ולפזר, כמו גם סוכני פיזור שונים. ואנחנו חושבים שזה חשוב לספק את זה בפורמט וידאו, כי ראינו שיש ניואנסים במיוחד את המסירה של הסוכן שמצאנו עבודה אופטימלית בעכברים.

כדי להתחיל, להעריך את המישור של הרדמה על ידי צביטה בוהן, ועל ידי ניטור קצב הנשימה ומאמץ. גילחו את משטח הגב והחילו קרם דפילטורי על האזור המגולח למשך 10 דקות, או לפי הוראות המוצר. מוציאים בעדינות את קרם ההשפלה.

ולוודא שהעור יבש. באמצעות סמן עמיד בפני אלכוהול, לצייר עיגול בקוטר של 1.5 ס"מ לכיוון האזור האחורי של הגב. לטיפול בכאב, לנהל 0.05 מיליליטר של לידוקאין תת עורית לתוך האזור כדי להיות מגורש.

ו-0.02 מיליליטר של בופרנורפין תת עורית בעורף. המתן 10 דקות כדי להבטיח הגעה לטיפול בכאב. לפני כריתה, לחטא את משטח הגב באמצעות ספוגית אלכוהול.

לשמור על שדה כירורגי סטרילי לאורך כל ההליך, ולהשתמש במכשירים autoclaved וכפפות סטריליות כדי להגביל את הזיהום. לנהל פצע עור כריתה בעובי מלא לרמה של שריר panniculus, עם מספריים כירורגיים. לאחר כריתה, מיד לכסות את הפצע עם רוטב פוליאוריתן למחצה.

בזהירות להפריד את הגיבוי מן ההלבשה באמצעות שני מלקחיים עדינים, אם רלוונטי. להזריק כ 10 ל CFU הרביעי של חיידקים, ו 100 מיקרוליטר PBS מתחת להלבשה על מיטת הפצע כדי ליצור זיהום. הערה, פצעים יכולים גם להיות נגועים במינים מרובים של חיידקים ו / או פטריות בו זמנית, או על ידי הצבת biofilms מעוצב מראש או אפילו רקמת debridement שחולצו מחולים על מיטת הפצע.

לאחר ההדבקה, מניחים עכברים בכלובים על גבי מגבות נייר כדי למנוע מהעכברים להיחנק מחומר המצעים. מניחים את הכלובים על רפידות חימום ומנטרים את העכברים עד שהם חוזרים לרפלקס הימני שלהם. הסר את מגבת הנייר בשלב זה.

אפשר זיהומים פצע להקים במשך 48 שעות. בדוק את ההלבשה מדי יום עבור דמעות באזורים של חוסר כבוד ולהחליף אותו במידת הצורך. מניחים עכברים תחת הרדמה isoflurane ב 3%וליטר אחד לדקה של חמצן, תוך מתן טיפולים.

להזריק 200 microliters של פתרון אנזים או בקרת PBS על הפצע על ידי הרמת העור מעט לפני הפצע עם מלקחיים, בזהירות פירסינג העור הרים עם המזרק, ולאט לאט מזריק את הפתרון לאזור בין מיטת הפצע ואת ההלבשה. כדי להבטיח כי מיטת הפצע כולו מכוסה בתמיסה, בעדינות להעלות את ההלבשה עם מלקחיים, מושך אותו ממיטת הפצע, תוך הזרקת הפתרון לאט. לאחר הטיפול, מניחים את העכברים בחזרה בכלובים במשך 30 דקות.

לאחר 30 דקות של חשיפה לטיפול, reanesthetize העכברים עם איזופלורן לשאוף את הפתרון הנותר עם מזרק, ניקוב באותו אזור כמו קודם. הערה, פתרון שאיפה זה מכיל תאים חיידקיים מפוזרים, אשר ניתן לשמור עבור ניתוחים שונים במורד הזרם. לנהל את טיפולי ההשקיה השני והשלישי כפי שנעשה עבור הראשון באמצעות מזרק חדש בכל פעם.

אם זן זוהר של חיידקים מנוצל כדי ליזום זיהום, מערכת הדמיה in-vivo יכול לשמש כדי לדמיין פיזור ממיטת הפצע. לצורך ניתוח, פתח את התמונות בתוכנת IVIS ובחר את האזור שיש לנתח באמצעות לוח הכלים. כדי להסביר את הרקע, הנח עיגול על רקע תמונה ולאחר מכן הניח את אותו עיגול בגודל על גבי מיטת הפצע עבור כל עכבר.

מתוך לוח הכלים, בחרו 'מדידת החזרי ROIs' והעלו את טבלת המידות לגיליון אלקטרוני. הפחת את קריאת מעגל הרקע מכל אחת ממדידות מיטת הפצע כדי לחשב זוהר עבור כל דגימה. לאחר המתת חסד אנושית, לקצור את רקמת מיטת הפצע על ידי הסרת ההלבשה בעדינות עם מלקחיים סטריליים, וחיתוך סביב היקף מיטת הפצע עם מספריים כירורגיים סטריליים.

השתמש מלקחיים בעדינות להרים קצה אחד של מיטת הפצע, ולאחר מכן להשתמש במספריים כדי לחתוך את דגימת הרקמה משכבה השריר. מניחים את דגימת הרקמה בצינור הומוגניזציה שני מיליליטר שקל מראש המכיל מיליליטר אחד של PBS. לשקול את הצינור שוב לאחר החדרת המדגם.

כדי לקצור את הטחול, מניחים את העכבר בעמדה אנטומית על-חושית ומאובטחים על-ידי הצמדת הגפיים למשטח ניתוח. משרים את האזור כדי להיות מנותח עם 70% אתנול כדי לסייע במניעת זיהום. הפוך חתך קטן בניצב לקו האמצע עם מספריים כירורגיים בדרמיס של הבטן התחתונה.

הקפידו למשוך את העור למעלה והתרחקות מהאיברים הפנימיים. המשך את החתך לאורך קו האמצע עד עצם החזה הוא הגיע. לאחר חלל הצפק נחשף ואת האיברים הפנימיים גלויים, להפריד את הטחול מרקמת החיבור ומניחים בצינור הומוגניזציה נפרד שקל מראש.

לשקול את הצינור שוב לאחר החדרת הטחול. הומוגניזציה הדגימות בחמישה מטרים לשנייה, במשך 60 שניות, פעמיים. כדי למנות CFU, לדלל באופן סדרתי צלחת נקודה דגימות הומוגניות.

לדלל באופן סדרתי על ידי pipetting 100 microliters של מדגם הומוגני לתוך 900 microliters של PBS וצינור צנטריפוגה 1.5 מיליליטר. וורטקס לפני המשך הדילול על ידי pipetting 100 microliters של מדגם מדולל לתוך צינור נפרד המכיל 900 microliters של PBS. חזור על שלבים אלה עד שישה דילולים מושגים.

פיפטה 10 מיקרוליטרים של כל דילול על האזור המצוין על צלחת אגר כפי שמוצג. אם נדרשת כמות CFU מדויקת יותר, מורחים 100 מיקרוליטרים של כל דילול של המדגם על פני לוחות אגר נפרדים. פצע ולהדביק עכברים עם כ 10 כדי CFU הרביעי של חיידקים, כמתואר בפרוטוקול in vivo.

אפשר לזיהום להקים במשך 48 שעות, ולאחר מכן לחלץ את מיטת הפצע באופן דומה לפרוטוקול in-vivo. התחל על ידי הסרת ההלבשה בזהירות. חותך סביב היקף הפצע.

ונפרד משכבה השריר. ניתן לחלק את דגימת מיטת הפצע למספר חלקים כדי להגדיל את מספר הדגימות. לאחר מכן מניחים את הדגימות המחולקות לצינורות הומוגניזציה ריקים נפרדים ששוקל מראש.

לשקול את הצינור שוב ולחשב את המשקל של המדגם על ידי חיסור המשקל של הצינור ללא המדגם ממשקל הצינור עם המדגם. מוסיפים מיליליטר אחד של PBS לצינור הומוגניזציה המכיל את המדגם, בעדינות להפוך את הצינור כמה פעמים לשטוף. הסר את שטיפת PBS והשליך.

הוסף מיליליטר אחד של טיפול GH, או PBS כפקד שלילי, ואת הדגירה במשך שעתיים ב 37 מעלות צלזיוס, עם רועד ב 80 סל"ד. מוציאים את המרה מתמיסת הפיזור ומניחים בצינור צנטריפוגה נפרד של 1.5 מיליליטר. זה מכיל את התאים המפוזרים.

לשטוף את הרקמה הנותרת עם מיליליטר אחד של PBS, כפי שנעשה בעבר, ולהשליך את לשטוף PBS. מוסיפים מיליליטר אחד של PBS לרקמה הנותרת והומוגניים בחמישה מטרים לשנייה, למשך 60 שניות. לדלל באופן סדרתי הן את הפתרון של תאים מפוזרים מדגם רקמה הומוגנית על ידי pipetting 100 microliters של המדגם לתוך 900 microliters של PBS בצינור צנטריפוגה 1.5 מיליליטר.

וורטקס המדגם מדולל ולהמשיך את הדילול חמש פעמים נוספות עבור סך של שישה דילולים. צלחת ספוט המדגם על ידי pipetting 10 microliters של כל דילול על האזור המצוין על צלחת אגר סלקטיבית. ספור את ה- CFU וחשב פיזור באחוזים על-ידי חלוקת ה- CFU המפוזר ב- CFU הכולל והכפלה ב- 100.

בניסוי זה, שמונה עד 10 שבועות נקבה עכברי וובסטר שוויצרי נדבקו 10 עד CFU הרביעי של PA01 נושאת את הזוהר pQF50-lux. הזיהום הורשה להקים במשך 48 שעות לפני ניהול שלושה טיפולים של 30 דקות של או PBS כבקרת רכב, או 10%GH כטיפול ניסיוני לעכל את EPS biofilm. מוצג בסעיף A, עכברים צולמו טרום טיפול, מיד לאחר הטיפול, וב 10 ו 20 שעות לאחר הטיפול.

באמצעות IVIS, זיהום מבוסס ניתן לדמיין בתוך מיטת הפצע יצירת אות bioluminescent בהיר. פיזור של חיידקים מתוך מיטת הפצע ניתן לדמיין מיד לאחר הטיפול GH, אבל לא לאחר הטיפול PBS. הפצה חיידקית לתוך האיברים ניתן לראות גם על ידי הנחת העכבר על צידו להדמיה, כפי שמוצג בלוחות התחתונים.

בסעיף B, תמונות הן של PBS והן של עכברים שטופלו ב-GH הראו עלייה באות הזוהר ב-20 שעות לאחר הטיפול, בהשוואה לטיפול מקדים. עם זאת, עדיין חשוב לכמת CFU בשל סף הזיהוי של זוהר ב- IVIS. בשעה 20 שעות לאחר הטיפול, העכברים היו מורדמים ומיטות הפצע והטחול נאספו כדי למנות CFU לגרם של רקמה.

סעיף C מראה את העומס החיידקי במיטת הפצע, בעוד סעיף D מראה את העומס החיידקי בטחול. נתונים אלה מצביעים על התפשטות מופצת של החיידקים המפוזרים, שכן חיידקים זוהו רק בטחול של העכברים שטופלו בתמיסת EPS-מיקוד GH. למרות פרוטוקולים אלה הם מאוד שימושי, יש כמה מגבלות.

ראשית, יש לציין כי קיימת מגבלת זיהוי עם מערכת ההדמיה in-vivo, או IVIS. ירידה באות הזוהר ניתן לראות כאשר החיידקים נכנסים לשלב נייח. לכן חשוב לאסוף רקמה של עניין ולמדוד את ה- CFU הנוכחי, שכן יכול להיות נתק בין הזוהר לבין CFU הממוין.

עם זאת, IVIS שימושי עבור לדמיין את היעילות של הטיפול לאורך כל המחקר, מבלי באמת להרדים את החיה. מגבלה נוספת שיש לקחת בחשבון היא הדרישה לפיקוח הדוק על התחבושות. התחבושות נדרשות כדי להפחית ריפוי התכווצות, כמו גם לשמור על הפצע סטרילי מחיידקים אחרים.

תחבושות יצטרכו להיות מוחלפות לעתים קרובות, אשר יכול להוביל לפסולת מקרית של הפצע והזדמנות לזיהום. פרוטוקולים אלה מתארים שיטות חדשניות לחקר מרה מפיזור, והערכת מרה טיפולית מסוכני פיזור. מודלים אלה מאפשרים פיתוח של זיהומים מורכבים הקשורים לביופילם פולימיקרוביאלי המחקים זיהומים אנושיים רלוונטיים קלינית.

תקוותנו היא כי פרוטוקולים אלה ינוצלו ומעודנים כדי לקדם את הפיתוח של סוכני פיזור אנטי ביופילם לשימוש טיפולי.