Murine Yaralarında Biyofilm Dağılımının Değerlendirilmesi

Mikrobiyologlar ve enfeksiyon hastalıkları hekimleri kronik hastalıkta biyofilm ilişkili enfeksiyonların ne kadar önemli olduğunu fark etmeye başlıyorlar. NIH, kronik enfeksiyonların % 80'inden fazlasının bakteriyel biyofilmlerden kaynaklandığını bile söylemiştir. Bu nedenle, biyofilm'in ele alınmasına ve biyofilm sorununu ele alan terapötiklerin geliştirilmesine vurgu yapmaya yöneliktir.

Ve bu terapötiklerin çoğu, biyofilmlerdeki bakteri hücrelerini biyofilmden dağıtmaya odaklanmıştır, böylece daha kolay öldürülebilirler. Ama literatürde şu anda böyle bir dağıtıcı ajanın etkinliğinin nasıl belirleneceklerine dair çok fazla protokol yok. Bu yüzden bunun iyi bir protokol olduğunu hissediyoruz.

Biyofilmle ilişkili bir bakteriyel enfeksiyon türü. Ayrıca, birçok farklı bakteri türünü ve biyofilmleri nasıl oluşturduklarını ve dağıldıklarını ve farklı dispersiyon maddelerini incelemek için oldukça kolay bir şekilde optimize edilebileceğini düşünüyoruz. Ve bunu bir video formatında sunmanın önemli olduğunu düşünüyoruz, çünkü özellikle farelerde en iyi şekilde iş bulduğumuz ajanın teslimatının nüansları olduğunu gördük.

Başlamak için, anestezi düzlemini parmak sıkışması ile ve solunum hızını ve çabasını izleyerek değerlendirin. Sırt yüzeyini tıraş edin ve tıraş edilen bölgeye 10 dakika boyunca veya ürünün talimatlarına göre bir depilatör krem uygulayın. Depilatör kremi yavaşça çıkarın.

Ve cildin kuru olduğundan emin olun. Alkol geçirmez bir işaretleyici kullanarak, sırtın arka bölgesine doğru 1,5 santimetre çapında bir daire çizin. Ağrı yönetimi için, eksize edilecek bölgeye deri altından 0,05 mililitre lidokrin sürün.

Ve boynunda deri altından 0.02 mililitre buprenorfin. Ağrı yönetimine ulaşıldığından emin olmak için 10 dakika bekleyin. Eksizyondan önce, bir alkol çubuğu kullanarak sırt yüzeyini dezenfekte edin.

İşlem boyunca steril bir cerrahi alan sağlayın ve kontaminasyonu sınırlamak için otomatik kapatılmış aletler ve steril eldivenler kullanın. Cerrahi makasla panniculus kas seviyesine tam kalınlıklı eksizyonel bir cilt yarası sürün. Eksizyondan sonra, yarayı hemen yarı geçirgen bir poliüretan pansuman ile örtün.

Varsa, iki ince uçlu mandip kullanarak sırtı pansumandan dikkatlice ayırın. Bir enfeksiyon oluşturmak için dördüncü bakteri CFU'suna yaklaşık 10 ve pansumanın altına ve yara yatağına 100 mikrolitre PBS enjekte edin. Ayrıca, yaralar aynı anda birden fazla bakteri ve/veya mantar türüyle veya hastalardan çıkarılan önceden biçimlendirilmiş biyofilmlerin hatta debridman dokusunun yara yatağına yerleştirilmesiyle de enfekte olabilir.

Enfeksiyondan sonra, farelerin yatak malzemesi üzerinde boğulmasını önlemek için fareleri kağıt havluların üstündeki kafeslere yerleştirin. Kafesleri ısıtma pedlerine yerleştirin ve fareleri sağ reflekslerini geri kazanana kadar izleyin. Bu noktada kağıt havluyu çıkarın.

Yara enfeksiyonlarının 48 saat boyunca kurulmasına izin verin. Her gün doğal olmayan alanlarda gözyaşı için pansumanı inceleyin ve gerekirse değiştirin. Tedavileri uygularken fareleri% 3 ve dakikada bir litre oksijende izofluran anestezisi altına yerleştirin.

Yaranın ön kısmını deriyi forsepsle hafifçe kaldırarak, kaldırılan cildi şırıngayla dikkatlice delerek ve çözeltiyi yavaşça yara yatağı ile pansuman arasındaki bölgeye enjekte ederek yaraya 200 mikrolitre enzim çözeltisi veya PBS kontrolü enjekte edin. Tüm yara yatağının çözelti ile kap olduğundan emin olmak için, çözeltiyi yavaşça enjekte ederken, pansumanı forsepsle hafifçe kaldırın, yara yatağından çekin. Tedaviden sonra, fareleri 30 dakika boyunca kafeslere geri yerleştirin.

Tedaviye 30 dakika maruz kaldıktan sonra, fareleri izofluran ile yeniden uyuşturun ve kalan çözeltiyi bir şırınna ile aspire edin, daha önce olduğu gibi aynı bölgede delinir. Bu aspire edilmiş çözeltinin, çeşitli aşağı akış analizleri için kaydedilebilecek dağınık bakteri hücreleri içerdiğini unutmayın. İkinci ve üçüncü sulama arıtmalarını her seferinde yeni bir şırıng kullanarak ilki için yapıldığı gibi yönetin.

Enfeksiyonu başlatmak için parlak bir bakteri suşu kullanılırsa, yara yatağından dağılımı görselleştirmek için bir in-vivo görüntüleme sistemi kullanılabilir. Analiz için, görüntüleri IVIS yazılımında açın ve araç paleti ile analiz edilecek alanı seçin. Arka planı hesaba katmak için, görüntünün arka planına bir daire yerleştirin ve ardından her fare için yara yatağının üzerine aynı büyüklükteki daireyi yerleştirin.

Araç paletinden RoI'leri ölç'ü seçin ve ölçüm tablosunu bir elektronik tabloya yükleyin. Her numune için lüminesansı hesaplamak için yara yatağı ölçümlerinin her birinden arka plan dairesi okumasını çıkarın. İnsancılı ötenaziden sonra, önce pansumanı steril tokalarla nazikçe çıkararak ve steril cerrahi makasla yara yatağının çevresini keserek yara yatağı dokusunu hasat edin.

Yara yatağının bir ucunun hafifçe kaldırılması için önseçim kullanın, ardından doku örneğini kas tabakasından kesmek için makas kullanın. Doku örneğini bir mililitre PBS içeren önceden tartılmış iki mililitrelik homojenizasyon tüpüne yerleştirin. Numuneyi yerleştirdikten sonra tüpü tekrar tartın.

Dalağını hasat etmek için, fareyi arka anatomik bir konuma getirin ve ekstremiteleri bir diseksiyon yüzeyine sabitleyerek sabitleyin. Kirlenmeyi önlemeye yardımcı olmak için% 70 etanol ile parçalanacak alanı ıslatın. Alt karın derminde cerrahi makas ile orta çizgiye dik küçük bir kesi yapın.

Cildi yukarı ve iç organlardan çektiğinizden emin olun. Sternuma ulaşılana kadar kesiği orta hat boyunca devam ettir. Periton boşluğu açığa çıktıktan ve iç organlar görünür olduğunda, dalağını bağ dokusundan ayırın ve önceden tartılmış ayrı bir homojenizasyon tüpüne yerleştirin.

Dalağını taktıktan sonra tüpü tekrar tartın. Örnekleri saniyede beş metrede, 60 saniye boyunca, iki kez homojenize edin. CFU'yu numaralandırmak için homojenize numuneleri seri olarak seyreltin ve tespit edin.

Homojenize numunenin 100 mikrolitresini 900 mikrolitre PBS ve 1,5 mililitre santrifüj tüpüne pipetleme ile seri olarak seyreltin. Seyreltilmiş numunenin 100 mikrolitresini 900 mikrolitre PBS içeren ayrı bir tüpe pipetleme ile seyreltme devam etmeden önce girdap. Altı seyreltme elde edilene kadar bu adımları tekrarlayın.

Pipet Her seyreltmenin 10 mikrolitresi gösterildiği gibi bir agar plakasında belirtilen alana. Daha hassas CFU nicelasyonu gerekiyorsa, numunenin her seyreltilmesinden 100 mikrolitreyi ayrı agar plakaları boyunca yayın. İn vivo protokolde açıklandığı gibi, fareleri yaklaşık 10 ila dördüncü CFU bakteri ile yaralar ve enfekte eder.

Enfeksiyonun 48 saat boyunca kurulmasına izin verin, ardından yara yatağını in-vivo protokole benzer bir şekilde çıkarın. Pansumanı dikkatlice çıkararak başlayın. Yaranın çevresini kesiyor.

Ve kas tabakasından ayrılıyor. Yara yatağı örneği, numune sayısını artırmak için birden fazla bölüme ayrılabilir. Daha sonra bölünmüş numuneleri önceden tartılmış ayrı boş homojenizasyon tüplerine yerleştirin.

Tüpü tekrar tartın ve numune ile tüpün ağırlığından numune olmadan tüpün ağırlığını çıkararak numunenin ağırlığını hesaplayın. Numuneyi içeren homojenizasyon tüpüne bir mililitre PBS ekleyin ve durulamak için tüpü birkaç kez hafifçe ters çevirin. PBS yıkamayı çıkarın ve atın.

Negatif kontrol olarak bir mililitre GH tedavisi veya PBS ekleyin ve 80 RPM'de sallanarak 37 santigrat derecede iki saat kuluçkaya yatırın. Safrayı dispersiyon çözeltisinden çıkarın ve ayrı bir 1,5 mililitre santrifüj tüpüne yerleştirin. Bu dağınık hücreleri içerir.

Kalan dokuyu daha önce yapıldığı gibi bir mililitre PBS ile yıkayın ve PBS yıkamayı atın. Kalan dokuya bir mililitre PBS ekleyin ve saniyede beş metrede 60 saniye homojenize edin. 1,5 mililitrelik santrifüj tüpünde 100 mikrolitre PBS'ye pipetleme ile hem dağınık hücrelerin çözeltisini hem de homojenize doku örneğini seri olarak seyreltin.

Seyreltilmiş numuneyi girdaplayın ve toplam altı seyreltme için seyreltmeye beş kez daha devam edin. Seçici bir agar plakası üzerinde belirtilen alana her seyreltmenin 10 mikrolitresini pipetleme ile numuneyi tespit edin. CFU'yu sayın ve dağınık CFU'yu toplam CFU'ya bölerek ve 100 ile çarparak yüzde dağılımını hesaplayın.

Bu deneyde, sekiz ila 10 haftalık dişi İsviçre Webster fareleri, lüminesans plazmid PQF50-lux taşıyan PA01'in dördüncü CFU'suna 10 ile enfekte oldu. Enfeksiyon, PBS'nin araç kontrolü olarak üç adet 30 dakikalık tedavisini veya biyofilm EPS'yi sindirmek için deneysel bir tedavi olarak% 10 GH'yi yönetmeden önce 48 saat boyunca kurulmasına izin verildi. A bölümünde gösterilen fareler, tedaviden hemen sonra ve tedavi sonrası 10 ve 20 saatte ön tedavi olarak görüntülendi.

IVIS kullanılarak, yara yatağı içinde parlak bir biyolüminesans sinyali üreten yerleşik bir enfeksiyon görselleştirilebilir. Bakterilerin yara yatağından dağılımı GH tedavisinden hemen sonra görselleştirilebilir, ancak PBS tedavisinden sonra değil. Alt panellerde gösterildiği gibi, fareyi görüntüleme için yanına yerleştirerek organlara bakteri yayılımları da görülebilir.

B bölümünde, hem PBS hem de GH ile tedavi edilen farelerden gelen görüntüler, tedavi sonrası 20 saatte, ön tedaviye kıyasla lüminesan sinyalde bir artış olduğunu göstermiştir. Bununla birlikte, IVIS'te bir lüminesans algılama eşiği nedeniyle CFU'nun nicel olması hala önemlidir. Tedaviden 20 saat sonra, fareler ötenaziye tabi tedavüle alındı ve yara yatakları ve dalaklar, CFU'nun gram doku başına numaralandırılması için toplandı.

Bölüm C yara yatağındaki bakteri yükünü gösterirken, D bölümü dalaklardaki bakteri yükünü gösterir. Bu veriler, dağınık bakterilerin yayılmasını göstermektedir, çünkü bakteriler sadece EPS hedefli GH çözeltisi ile tedavi edilen farelerin dalaklarında tespit edildi. Bu protokoller çok yararlı olsa da, bazı sınırlamalar vardır.

İlk olarak, in-vivo görüntüleme sistemi veya IVIS ile bir algılama sınırlaması olduğu belirtilmelidir. Bakteriler sabit faza girdiğinde lüminesan sinyalde bir azalma görülebilir. Bu nedenle, luminesans ve CFU numaralandırılmış arasında bir kopukluk olabileceği için, ilgi dokusunu toplamak ve mevcut CFU'nun ölçülebilmesi önemlidir.

Bununla birlikte, IVIS, hayvanı gerçekten ötenazi yapmak zorunda kalmadan, bir çalışma boyunca tedavinin etkinliğini görselleştirmek için yararlıdır. Dikkate alınması gereken bir diğer sınırlama da bandajların yakından izlenmesi gereksinimidir. Bandajlar, kontnaktil iyileşmeyi azaltmak ve yarayı diğer bakterilerden steril tutmak için gereklidir.

Bandajların sık sık değiştirilmesi gerekecektir, bu da yaranın kazara debridmanlanmasına ve kirlenme fırsatına yol açabilir. Bu protokoller, safrayı dağılımdan incelemek için yeni yöntemleri ve dispersiyon ajanlarından terapötik safranın değerlendirilmesini açıklar. Bu modeller, klinik olarak ilgili insan enfeksiyonlarını taklit eden karmaşık polimikrobiyal biyofilm ilişkili enfeksiyonların gelişmesine izin verir.

Umudumuz, bu protokollerin terapötik kullanım için anti-biyofilm dispersiyon ajanlarının geliştirilmesi için kullanılması ve rafine edilmesidir.