Los microbiólogos y los médicos de enfermedades infecciosas están empezando a darse cuenta de lo importantes que son las infecciones asociadas a biopelículas en las enfermedades crónicas. Los NIH incluso han dicho que más del 80% de las infecciones crónicas se deben a biopelículas bacterianas. Así que esto ha instado al énfasis en abordar el biofilm, y el desarrollo de terapias que aborden el problema del biofilm.
Y un lotta esas terapias se centran en la dispersión de las células bacterianas que están en las biopelículas fuera de la biopelícula para que puedan ser más fácilmente asesinados. Pero realmente no hay muchos protocolos en la literatura actual que aborden cómo determinar la eficacia de tal agente de dispersión. Así que sentimos que este es un buen protocolo para usar.
Es un tipo de infección bacteriana que está asociada a biopelículas. Y también creemos que se puede optimizar con bastante facilidad para estudiar muchos tipos diferentes de especies bacterianas, y cómo forman biopelículas y se dispersan, así como diferentes agentes de dispersión. Y creemos que es importante entregar esto en un formato de video, porque hemos visto que hay matices, especialmente en la entrega del agente que hemos encontrado que funcionan de manera óptima en ratones.
Para comenzar, evalúe el plano de la anestesia por el pellizco del dedo deldo deldo del edo del dólar, y supervisando el ritmo respiratorio y el esfuerzo. Afeitarse la superficie dorsal y aplicar una crema depilatoria a la región afeitada durante 10 minutos, o según las instrucciones del producto. Retire suavemente la crema depilatoria.
Y asegúrese de que la piel esté seca. Usando un marcador a prueba de alcohol, dibuje un círculo con un diámetro de 1,5 centímetros hacia la región posterior de la espalda. Para el manejo del dolor, administre 0,05 mililitros de lidocaína por vía subcutánea en el área a extirpar.
Y 0,02 mililitros de buprenorfina por vía subcutánea en el cuello. Espere 10 minutos para asegurarse de que se alcance el manejo del dolor. Antes de la escisión, desinfecte la superficie dorsal con un hisopo de alcohol.
Mantenga un campo quirúrgico estéril durante todo el procedimiento y use instrumentos en autoclave y guantes estériles para limitar la contaminación. Administrar una herida cutánea escisional de espesor completo al nivel del músculo panniculus, con tijeras quirúrgicas. Después de la supresión, cubra inmediatamente la herida con un apósito de poliuretano semipermeable.
Separe cuidadosamente el respaldo del apósito usando dos pórceps de punta fina, si corresponde. Inyecte aproximadamente 10 a la cuarta UFC de bacterias, y 100 microlitros PBS debajo del apósito y en el lecho de la herida para establecer una infección. Tenga en cuenta que las heridas también pueden infectarse con múltiples especies de bacterias y / u hongos simultáneamente, o colocando biopelículas preformadas o incluso tejido de desbridamiento extraído de los pacientes en el lecho de la herida.
Después de la infección, coloque a los ratones en jaulas encima de las toallas de papel para evitar que los ratones se asfixonen en el material de la ropa de cama. Coloque las jaulas en almohadillas de calefacción y supervise a los ratones hasta que hayan recuperado su reflejo derecho. Retire la toalla de papel en este punto.
Permita que las infecciones de la herida se establezcan durante 48 horas. Inspeccione el apósito diariamente en busca de desgarros en áreas de no conformidad y reemplácelo si es necesario. Coloque los ratones bajo anestesia con isoflurano al 3% y un litro por minuto de oxígeno, mientras administra los tratamientos.
Inyecte 200 microlitros de solución enzimática o control de PBS sobre la herida levantando la piel ligeramente anterior de la herida con las medidas de control, perforando cuidadosamente la piel levantada con la jeringa e inyectando lentamente la solución en el área entre el lecho de la herida y el apósito. Para asegurarse de que todo el lecho de la herida esté cubierto por una solución, levante suavemente el apósito con las fuerzas, alejándolo del lecho de la herida, mientras inyecta lentamente la solución. Después del tratamiento, coloque a los ratones de nuevo en jaulas durante 30 minutos.
Después de 30 minutos de exposición al tratamiento, reanesthetize los ratones con isoflurane y aspire la solución restante con una jeringuilla, perforando en la misma área que antes. Tenga en cuenta que esta solución aspirada contiene células bacterianas dispersas, que pueden guardarse para varios análisis posteriores. Administrar el segundo y tercer tratamiento de riego como se hizo para el primero utilizando una jeringa nueva cada vez.
Si una tensión luminiscente de bacterias se utiliza para iniciar la infección, un sistema in vivo de la proyección de imagen se puede utilizar para visualizar la dispersión de la cama de la herida. Para el análisis, abra las imágenes en el software IVIS y seleccione el área a analizar con la paleta de herramientas. Para tener en cuenta el fondo, coloque un círculo en el fondo de una imagen y, a continuación, coloque el mismo círculo del tamaño en la parte superior del lecho de la herida para cada ratón.
En la paleta de herramientas, seleccione Medir ROIs y cargue la tabla de medidas en una hoja de cálculo. Reste la lectura del círculo de fondo de cada una de las mediciones del lecho de la herida para calcular la luminiscencia de cada muestra. Después de la eutanasia humana, coseche el tejido del lecho de la herida quitando primero suavemente el apósito con fórceps estériles, y cortando alrededor del perímetro de la cama de la herida con tijeras quirúrgicas estériles.
Use fórceps para levantar suavemente un extremo del lecho de la herida, luego use tijeras para cortar la muestra de tejido lejos de la capa muscular. Coloque la muestra de tejido en un tubo de homogeneización de dos mililitros prepesado que contenga un mililitro de PBS. Vuelva a pesar el tubo después de insertar la muestra.
Para cosechar el bazo, coloque el ratón en una posición anatómica supina y asegure fijando las extremidades a una superficie de disección. Remoje el área a diseccionar con etanol al 70% para ayudar a prevenir la contaminación. Haga una pequeña incisión perpendicular a la línea media con tijeras quirúrgicas en la dermis de la parte inferior del abdomen.
Asegúrese de levantar y alejar la piel de los órganos internos. Continúe la incisión a lo largo de la línea media hasta que se alcance el esternón. Una vez que la cavidad peritoneal está expuesta y los órganos internos son visibles, separe el bazo del tejido conectivo y colóque lo coloque en un tubo de homogeneización prepesado separado.
Pesar el tubo de nuevo después de insertar el bazo. Homogeneizar las muestras a cinco metros por segundo, durante 60 segundos, dos veces. Para enumerar la UFC, diluya y detecte en serie las muestras homogeneizadas.
Diluir en serie pipeteando 100 microlitros de la muestra homogeneizada en 900 microlitros de PBS y un tubo centrífugo de 1,5 mililitros. Vórtice antes de continuar la dilución pipeteando 100 microlitros de la muestra diluida en un tubo separado que contiene 900 microlitros de PBS. Repita estos pasos hasta que se logren seis diluciones.
Pipetee 10 microlitros de cada dilución en el área indicada en una placa de agar como se muestra. Si se requiere una cuantificación de UFC más precisa, extienda 100 microlitros de cada dilución de la muestra a través de placas de agar separadas. Hiere e infecta ratones con aproximadamente 10 a la cuarta UFC de bacterias, como se describe en el protocolo in vivo.
Deje que la infección se establezca durante 48 horas, luego extraiga el lecho de la herida de una manera similar al protocolo in vivo. Comience por quitar cuidadosamente el apósito. Corte alrededor del perímetro de la herida.
Y la separación de la capa muscular. La muestra del lecho de la herida se puede dividir en varias secciones para aumentar el número de muestras. Luego coloque las muestras divididas en tubos de homogeneización vacíos prepesados separados.
Pesar el tubo de nuevo y calcular el peso de la muestra restando el peso del tubo sin la muestra del peso del tubo con la muestra. Agregue un mililitro de PBS al tubo de homogeneización que contiene la muestra e invierta suavemente el tubo unas cuantas veces para enjuagar. Retire el pbs lavar y desechar.
Añadir un mililitro de tratamiento gh, o PBS como un control negativo, e incubar durante dos horas a 37 grados Centígrados, con agitación a 80 RPM. Retire la bilis de la solución de dispersión y colóquela en un tubo centrífugo separado de 1,5 mililitros. Esto contiene las celdas dispersas.
Lave el tejido restante con un mililitro de PBS, como se hizo anteriormente, y deseche el lavado de PBS. Añadir un mililitro de PBS al tejido restante y homogeneizar a cinco metros por segundo, durante 60 segundos. Diluya en serie tanto la solución de células dispersas como la muestra de tejido homogeneizado pipeteando 100 microlitros de la muestra en 900 microlitros de PBS en un tubo centrífugo de 1,5 mililitros.
Vórtice la muestra diluida y continúe la dilución cinco veces más para un total de seis diluciones. Detecte la muestra pipeteando 10 microlitros de cada dilución sobre el área indicada en una placa de agar selectiva. Cuente la UFC y calcule el porcentaje de dispersión dividiendo la UFC dispersa por la UFC total y multiplicándola por 100.
En este experimento, ocho a 10 ratones suizos hembra de la semana de la semana fueron infectados con 10 a la cuarta UFC de PA01 que llevaba el plásmido de la luminiscencia PQF50-lux. La infección fue permitida establecer por 48 horas antes de administrar tres tratamientos de 30 minutos de PBS como control del vehículo, o el 10% GH como tratamiento experimental para digerir el biofilm EPS. Mostrados en la sección A, los ratones fueron fototratado antes del tratamiento, directamente después del tratamiento, y en 10 y 20 horas después del tratamiento.
Usando IVIS, una infección establecida se puede visualizar dentro de la cama de la herida que genera una señal bioluminiscente brillante. La dispersión de bacterias fuera de la cama de la herida se puede visualizar inmediatamente después del tratamiento del GH, pero no después del tratamiento de PBS. La diseminación bacteriana en los órganos también se puede ver colocando el ratón en su lado para la toma de imágenes, como se muestra en los paneles inferiores.
En la sección B, las imágenes del PBS y de los ratones GH-tratados demostraron un aumento en señal luminiscente en 20 horas del poste-tratamiento, comparado al tratamiento previo. Sin embargo, todavía es importante cuantificar la UFC debido al umbral de detección de una luminiscencia en IVIS. En 20 horas del poste-tratamiento, los ratones fueron euthanized y las camas de la herida y los bazos fueron recogidos para enumerar CFU por el gramo de tejido.
La sección C muestra la carga bacteriana en el lecho de la herida, mientras que la sección D muestra la carga bacteriana en el bazo. Estos datos sugieren la extensión diseminada de las bacterias dispersas, puesto que las bacterias fueron detectadas solamente en los bazos de los ratones tratados con la solución EPS-apuntando del GH. Aunque estos protocolos son muy útiles, hay algunas limitaciones.
En primer lugar, debe tenerse en cuenta que hay una limitación de detección con el sistema de imágenes in vivo, o IVIS. Una disminución en la señal luminiscente se puede ver cuando las bacterias entran en fase estacionaria. Por lo tanto, es importante recolectar tejido de interés y medir la UFC presente, ya que puede haber una desconexión entre la luminiscencia y la UFC enumerada.
Sin embargo, IVIS es útil para visualizar la eficacia del tratamiento a lo largo de un estudio, sin tener que eutanasiar realmente al animal. Otra limitación a tener en cuenta es el requisito de una estrecha vigilancia de los vendajes. Los vendajes son necesarios para reducir la cicatrización contráctil, así como mantener la herida estéril de otras bacterias.
Los vendajes tendrán que ser reemplazados a menudo, lo que puede conducir al desbridamiento accidental de la herida y la oportunidad de contaminación. Estos protocolos describen métodos nuevos para estudiar la bilis de la dispersión, y la evaluación de la bilis terapéutica de los agentes de la dispersión. Estos modelos permiten el desarrollo de infecciones complejas asociadas a biopelículas polimicrobianas que imitan infecciones humanas clínicamente relevantes.
Nuestra esperanza es que estos protocolos sean utilizados y refinados para promover el desarrollo de agentes de dispersión anti-biopelícula para uso terapéutico.
