Микробиологи и врачи-инфекционисты начинают понимать, насколько важны инфекции, связанные с биопленкой, при хронических заболеваниях. NIH даже заявил, что более 80% хронических инфекций связаны с бактериальными биопленками. Таким образом, это побудило уделить особое внимание решению проблемы биопленки и разработке терапевтических средств, которые решают проблему биопленки.
И многие из этих терапевтических средств сосредоточены на диспергировании бактериальных клеток, которые находятся в биопленках, из биопленки, чтобы их можно было легче убить. Но в настоящее время в литературе не так много протоколов, которые касаются того, как определить эффективность такого рассеивателя. Таким образом, мы чувствуем, что это хороший протокол для использования.
Это один из типов бактериальной инфекции, который связан с биопленкой. И мы также считаем, что можно довольно легко оптимизировать изучение многих различных типов видов бактерий и того, как они образуют биопленки и диспергируются, а также различные диспергирующие агенты. И мы считаем важным доставить это в видеоформате, потому что мы видели, что есть нюансы, особенно в доставке агента, который мы нашли оптимальной работой на мышах.
Для начала оцените плоскость анестезии по защемлку носа, а также по контролю за частотой дыхания и усилием. Побрейте дорсальную поверхность и нанесите крем для депиляции на бритую область на 10 минут или в соответствии с инструкцией к продукту. Аккуратно снимите крем для депиляции.
И убедитесь, что кожа сухая. С помощью спиртостойкого маркера нарисуйте круг диаметром 1,5 сантиметра в сторону задней области спины. Для лечения боли вводят 0,05 миллилитра лидокаина подкожно в область, которая должна быть иссекаема.
И 0,02 миллилитра бупренорфина подкожно в неряшливости шеи. Подождите 10 минут, чтобы убедиться, что лечение боли достигнуто. Перед иссечением продезинфицируйте дорсальную поверхность с помощью спиртового тампона.
Поддерживайте стерильное хирургическое поле на протяжении всей процедуры и используйте автоклавные инструменты и стерильные перчатки для ограничения загрязнения. Вводят полную толщину эксцизионной раны кожи до уровня панникулусной мышцы хирургическими ножницами. После иссечения сразу же накройте рану полупроницаемой полиуретановой повязкой.
Тщательно отделите подложку от повязки с помощью двух щипцов с тонкими наконечниками, если это применимо. Вводят примерно от 10 до четвертого КОЕ бактерий и 100 микролитров PBS под повязку и на раневое ложе, чтобы установить инфекцию. Обратите внимание, что раны также могут быть инфицированы несколькими видами бактерий и/или грибков одновременно или путем размещения предварительно сформированных биопленок или даже ткани санировки, извлеченных из пациентов, на раневое ложе.
После заражения поместите мышей в клетки поверх бумажных полотенец, чтобы мыши не задохнулись на материале подстилки. Поместите клетки на грелки и следите за мышами, пока они не восстановят свой правый рефлекс. На этом этапе снимите бумажное полотенце.
Дайте раневым инфекциям установиться в течение 48 часов. Ежедневно осматривайте повязку на предмет разрывов в местах несоблюдения и при необходимости заменяйте ее. Поместите мышей под изофлурановую анестезию при 3% и одном литре в минуту кислорода, во время лечения.
Вводят 200 микролитров ферментного раствора или PBS-контроля на рану, поднимая кожу слегка передней части раны щипцами, тщательно прокалывая поднятую кожу шприцем и медленно вводя раствор в область между раневым ложем и повязкой. Чтобы убедиться, что все раневое ложе покрыто раствором, осторожно поднимите повязку щипцами, оттягивая ее от раневого ложа, при этом медленно вводя раствор. После обработки поместите мышей обратно в клетки на 30 минут.
После 30 минут воздействия обработки реанестезируйте мышей изофлураном и аспирируйте оставшийся раствор шприцем, проколов в той же области, что и раньше. Обратите внимание, что этот аспирированный раствор содержит дисперсные бактериальные клетки, которые могут быть сохранены для различных последующих анализов. Проводите вторую и третью оросительную обработку, как это было сделано для первого, используя новый шприц каждый раз.
Если люминесцентный штамм бактерий используется для инициирования инфекции, система визуализации in vivo может быть использована для визуализации рассеивания из раневого ложа. Для анализа откройте изображения в программном обеспечении IVIS и выберите область для анализа с помощью инструментальной палитры. Чтобы учесть фон, поместите круг на фон изображения, а затем поместите круг одинакового размера поверх раневого ложа для каждой мыши.
В палитре инструментов выберите Измерить рентабельность инвестиций и загрузите таблицу измерений в электронную таблицу. Вычтите показания фонового круга из каждого измерения раневого ложа, чтобы рассчитать люминесценцию для каждого образца. После гуманную эвтаназию собирают ткань раневого ложа, сначала аккуратно сняв повязку стерильными щипцами, и разрезав по периметру раневого ложа стерильными хирургическими ножницами.
Используйте щипцы, чтобы осторожно поднять один конец раневого ложа, затем используйте ножницы, чтобы отрезать образец ткани от мышечного слоя. Поместите образец ткани в предварительно взвешенную двухмиллилитровую гомогенизационную трубку, содержащую один миллилитр PBS. Взвесьте трубку еще раз после введения образца.
Чтобы собрать селезенку, поместите мышь в анатомическое положение лежа на спине и закрепите, прикрепив конечности к поверхности рассечения. Замочите область, которая будет рассечена 70% этанолом, чтобы предотвратить загрязнение. Сделайте небольшой разрез перпендикулярно средней линии хирургическими ножницами в дерме нижней части живота.
Обязательно подтягивайте кожу вверх и прочь от внутренних органов. Продолжайте разрез вдоль средней линии до тех пор, пока не будет достигнута грудина. Как только брюшинная полость обнажится и внутренние органы будут видны, отделите селезенку от соединительной ткани и поместите в отдельную предварительно взвешенную гомогенизационную трубку.
Взвесьте трубку еще раз после введения селезенки. Гомогенизируйте образцы со скоростью пять метров в секунду, в течение 60 секунд, два раза. Чтобы перечислить КОЕ, последовательно разбавляйте и пятно пластинчатые гомогенизированные образцы.
Последовательно разбавляют путем пипетирования 100 микролитров гомогенизированного образца в 900 микролитров PBS и 1,5-миллилитровую центрифужную трубку. Вихрь перед продолжением разбавления путем пипетирования 100 микролитров разбавленного образца в отдельную трубку, содержащую 900 микролитров ПБС. Повторяйте эти шаги до тех пор, пока не будет достигнуто шесть разведений.
Пипетка 10 микролитров каждого разведения на указанную область на агаровой пластине, как показано на рисунке. Если требуется более точное количественное уточнение КОЕ, распределите 100 микролитров каждого разбавления образца по отдельным пластинам агара. Ранят и инфицировать мышей примерно от 10 до четвертого КОЕ бактерий, как описано в протоколе in vivo.
Дайте инфекции установиться в течение 48 часов, затем извлеките раневое ложе аналогично протоколу in vivo. Начните с осторожного снятия повязки. Разрезание по периметру раны.
И отделяясь от мышечного слоя. Образец раневого ложа может быть разделен на несколько секций для увеличения количества образцов. Затем поместите разделенные образцы в отдельные предварительно взвешенные пустые гомогенизационные трубки.
Еще раз взвесьте трубку и рассчитайте вес образца, вычитая вес пробирки без образца из веса пробирки с образцом. Добавьте один миллилитр PBS в гомогенизационную трубку, содержащую образец, и осторожно переверьте трубку несколько раз для промывки. Удалите PBS, вымывайте и выбрасывайте.
Добавьте один миллилитр обработки ГР, или PBS в качестве отрицательного контроля, и инкубируйте в течение двух часов при 37 градусах Цельсия, с встряхиванием при 80 оборотах в минуту. Удалите желчь из диспергированного раствора и поместите в отдельную 1,5-миллилитровую центрифужную трубку. Он содержит дисперсные клетки.
Вымойте оставшуюся ткань одним миллилитром PBS, как это было сделано ранее, и откажитесь от промывки PBS. Добавьте один миллилитр PBS к оставшейся ткани и гомогенизируйте со скоростью пять метров в секунду, в течение 60 секунд. Последовательно разбавляют как раствор дисперсных клеток, так и гомогенизированный образец ткани путем пипетирования 100 микролитров образца в 900 микролитров PBS в 1,5-миллилитровой центрифужной трубке.
Вихрь разбавленный образец и продолжайте разбавление еще пять раз в общей сложности шесть разведений. Точечная пластина образца путем пипетирования 10 микролитров каждого разбавления на указанную область на селективной агаровой пластине. Подсчитайте КОЕ и рассчитайте процентное рассеивание, разделив дисперсный КОЕ на общий КОЕ и умножив на 100.
В этом эксперименте от восьми до 10 недель самки швейцарских мышей Вебстера были инфицированы от 10 до четвертого КОЕ PA01, несущего люминесцентную плазмиду PQF50-lux. Инфекцию было разрешено установить в течение 48 часов до начала трех 30-минутных процедур либо PBS в качестве контроля транспортного средства, либо 10% GH в качестве экспериментального лечения для переваривания биопленки EPS. Показанные в разделе А, мыши были изображены до лечения, непосредственно после лечения и через 10 и 20 часов после лечения.
Используя IVIS, установленная инфекция может быть визуализирована в раневом ложе, генерируя яркий биолюминесцентный сигнал. Рассеивание бактерий из раневого ложа может быть визуализировано сразу после лечения ГР, но не после лечения PBS. Распространение бактерий в органы также можно увидеть, поместив мышь на бок для визуализации, как показано на нижних панелях.
В разделе B изображения мышей, обработанных PBS и GH, продемонстрировали увеличение люминесцентного сигнала через 20 часов после обработки по сравнению с предварительным лечением. Тем не менее, по-прежнему важно количественно оценить КОЕ из-за порога обнаружения люминесценции в IVIS. Через 20 часов после лечения мышей усыпляли, а раневые ложа и селезенку собирали для перечисления КОЕ на грамм ткани.
Раздел C показывает бактериальную нагрузку в раневом сложении, в то время как раздел D показывает бактериальную нагрузку в селезенке. Эти данные свидетельствуют о диссеминированном распространении дисперсных бактерий, поскольку бактерии были обнаружены только в селезенке мышей, обработанных раствором ГР, нацеленным на EPS. Хотя эти протоколы очень полезны, есть некоторые ограничения.
Во-первых, следует отметить, что существует ограничение обнаружения с системой визуализации in-vivo, или IVIS. Снижение люминесцентного сигнала можно увидеть, когда бактерии входят в стационарную фазу. Поэтому важно собрать интересующих тканей и измерить присутствуют КОЕ, так как может быть разрыв между перечисленной люминесценцией и КОЕ.
Тем не менее, IVIS полезен для визуализации эффективности лечения на протяжении всего исследования, без необходимости фактически усыплять животное. Еще одним ограничением, которое следует учитывать, является требование тщательного контроля за бинтами. Повязки необходимы для уменьшения сократительного заживления, а также для сохранения раны стерильной от других бактерий.
Повязки нужно будет часто заменять, что может привести к случайной санации раны и возможности заражения. Эти протоколы описывают новые методы изучения желчи от рассеивания и оценки терапевтической желчи от диспергирующие агенты. Эти модели позволяют развить сложные полимикробные биопленоацеплентные инфекции, которые имитируют клинически значимые инфекции человека.
Мы надеемся, что эти протоколы будут использоваться и совершенствоваться для дальнейшей разработки антибиопленочных диспергаторов для терапевтического использования.
