Les microbiologistes et les infectiologues commencent à réaliser à quel point les infections associées au biofilm sont importantes dans les maladies chroniques. Les NIH ont même déclaré que plus de 80% des infections chroniques sont dues à des biofilms bactériens. Cela a donc incité à mettre l’accent sur le biofilm et à développer des thérapies qui s’attaquent au problème du biofilm.
Et beaucoup de ces thérapies sont axées sur la dispersion des cellules bactériennes qui sont dans les biofilms hors du biofilm afin qu’elles puissent être plus facilement tuées. Mais il n’y a vraiment pas beaucoup de protocoles dans la littérature actuellement qui traitent de la façon de déterminer l’efficacité d’un tel agent de dispersion. Nous pensons donc que c’est un bon protocole à utiliser.
C’est un type d’infection bactérienne qui est associé au biofilm. Et nous pensons aussi qu’il peut être optimisé assez facilement pour étudier de nombreux types différents d’espèces bactériennes, et comment ils forment des biofilms et se dispersent, ainsi que différents agents de dispersion. Et nous pensons qu’il est important de fournir cela dans un format vidéo, parce que nous avons vu qu’il y a des nuances à la livraison de l’agent que nous avons trouvé de travail optimal chez la souris.
Pour commencer, évaluez le plan d’anesthésie par pincement des pincements aux yeux et en surveillant la fréquence respiratoire et l’effort. Rasez la surface dorsale et appliquez une crème dépilatoire sur la région rasée pendant 10 minutes, ou selon les instructions du produit. Retirez doucement la crème dépilatoire.
Et assurez-vous que la peau est sèche. À l’aide d’un marqueur anti-alcool, dessinez un cercle d’un diamètre de 1,5 centimètre vers la région postérieure du dos. Pour la gestion de la douleur, administrer 0,05 millilitres de lidocaïne par voie sous-cutanée dans la zone à exciser.
Et 0,02 millilitres de buprénorphine par voie sous-cutanée dans la peau du cou. Attendez 10 minutes pour vous assurer que la gestion de la douleur est atteinte. Avant l’excision, désinfectez la surface dorsale à l’aide d’un écouvillon d’alcool.
Maintenez un champ chirurgical stérile tout au long de la procédure et utilisez des instruments autoclavés et des gants stériles pour limiter la contamination. Administrer une plaie de peau excisionnelle de pleine épaisseur au niveau du muscle panniculus, avec des ciseaux chirurgicaux. Après l’excision, couvrir immédiatement la plaie avec un pansement en polyuréthane semi-perméable.
Séparez soigneusement le support du pansement à l’aide de deux pinces à pointe fine, le cas échéant. Injecter environ 10 à la quatrième UFC de bactéries, et 100 microlitres PBS sous le pansement et sur le lit de la plaie pour établir une infection. Notez que les plaies peuvent également être infectées par plusieurs espèces de bactéries et /ou de champignons simultanément, ou en plaçant des biofilms préformés ou même du tissu de débridement extrait des patients sur le lit de la plaie.
Après l’infection, placez les souris dans des cages sur des serviettes en papier pour empêcher les souris de s’asphyxie sur le matériau de la literie. Placez les cages sur des coussins chauffants et surveillez les souris jusqu’à ce qu’elles aient retrouvé leur réflexe de redressement. Retirez l’essuie-tout à ce stade.
Laisser les infections des plaies s’établir pendant 48 heures. Inspectez quotidiennement le pansement pour les déchirures dans les zones de nonadherence et remplacez-le si nécessaire. Placez les souris sous anesthésie isoflurane à 3% et un litre par minute d’oxygène, tout en administrant des traitements.
Injectez 200 microlitres de solution enzymatique ou de contrôle PBS sur la plaie en soulevant la peau légèrement antérieure de la plaie avec une pince, en perçant soigneusement la peau soulevée avec la seringue et en injectant lentement la solution dans la zone située entre le lit de la plaie et le pansement. Pour vous assurer que tout le lit de la plaie est recouvert d’une solution, soulevez doucement le pansement avec une pince, en l’éloignant du lit de la plaie, tout en injectant lentement la solution. Après le traitement, replacez les souris dans des cages pendant 30 minutes.
Après 30 minutes d’exposition au traitement, réanesthétiser les souris avec de l’isoflurane et aspirer la solution restante avec une seringue, en perforant dans la même zone qu’auparavant. Notez que cette solution aspirée contient des cellules bactériennes dispersées, qui peuvent être conservées pour diverses analyses en aval. Administrer les deuxième et troisième traitements d’irrigation comme cela a été fait pour le premier à l’aide d’une nouvelle seringue à chaque fois.
Si une souche luminescente de bactéries est utilisée pour initier l’infection, un système d’imagerie in vivo peut être utilisé pour visualiser la dispersion du lit de la plaie. Pour l’analyse, ouvrez les images dans le logiciel IVIS et sélectionnez la zone à analyser avec la palette d’outils. Pour tenir compte de l’arrière-plan, placez un cercle sur l’arrière-plan d’une image, puis placez le même cercle de taille sur le lit de plaie pour chaque souris.
Dans la palette d’outils, sélectionnez Mesurer les ROIs et téléchargez la table des mesures dans une feuille de calcul. Soustrayez la lecture du cercle de fond de chacune des mesures du lit de plaie pour calculer la luminescence pour chaque échantillon. Après une euthanasie sans cruauté, récoltez le tissu du lit de la plaie en enlevant d’abord doucement le pansement avec une pince stérile et en coupant autour du périmètre du lit de la plaie avec des ciseaux chirurgicaux stériles.
Utilisez une pince pour soulever doucement une extrémité du lit de la plaie, puis utilisez des ciseaux pour couper l’échantillon de tissu loin de la couche musculaire. Placer l’échantillon de tissu dans un tube d’homogénéisation de deux millilitres pré-pesé contenant un millilitre de PBS. Peser à nouveau le tube après avoir inséré l’échantillon.
Pour récolter la rate, placez la souris dans une position anatomique couchée sur le décubitus dorsal et fixez-la en épinglant les extrémités à une surface de dissection. Faites tremper la zone à disséquer avec de l’éthanol à 70% pour aider à prévenir la contamination. Faire une petite incision perpendiculaire à la ligne médiane avec des ciseaux chirurgicaux dans le derme du bas-ventre.
Assurez-vous de tirer la peau vers le haut et loin des organes internes. Continuer l’incision le long de la ligne médiane jusqu’à ce que le sternum soit atteint. Une fois que la cavité péritonéale est exposée et que les organes internes sont visibles, séparez la rate du tissu conjonctif et placez-la dans un tube d’homogénéisation pré-pesé séparé.
Peser à nouveau le tube après avoir inséré la rate. Homogénéiser les échantillons à cinq mètres par seconde, pendant 60 secondes, deux fois. Pour énumérer l’UFC, diluer en série et plaque ponctuelle les échantillons homogénéisés.
Diluer en série par pipetage 100 microlitres de l’échantillon homogénéisé en 900 microlitres de PBS et un tube centrifugeur de 1,5 millilitre. Vortex avant de poursuivre la dilution par canalisation de 100 microlitres de l’échantillon dilué dans un tube séparé contenant 900 microlitres de PBS. Répétez ces étapes jusqu’à ce que six dilutions soient atteintes.
Pipetter 10 microlitres de chaque dilution sur la zone indiquée sur une plaque de gélose comme indiqué. Si une quantification plus précise de l’UFC est nécessaire, étaler 100 microlitres de chaque dilution de l’échantillon sur des plaques de gélose distinctes. Enroulé et infecter des souris avec environ 10 à la quatrième UFC de bactéries, comme décrit dans le protocole in vivo.
Laissez l’infection s’établir pendant 48 heures, puis extrayez le lit de la plaie de la même manière que le protocole in vivo. Commencez par retirer soigneusement le pansement. Coupe autour du périmètre de la plaie.
Et se séparer de la couche musculaire. L’échantillon de lit de plaie peut être divisé en plusieurs sections pour augmenter le nombre d’échantillons. Placez ensuite les échantillons divisés dans des tubes d’homogénéisation vides pré-pesés séparés.
Peser à nouveau le tube et calculer le poids de l’échantillon en soustrayant le poids du tube sans l’échantillon du poids du tube avec l’échantillon. Ajouter un millilitre de PBS au tube d’homogénéisation contenant l’échantillon et inverser doucement le tube plusieurs fois pour le rincer. Retirez le lavage pbs et jetez-le.
Ajouter un millilitre de traitement GH, ou PBS comme un contrôle négatif, et incuber pendant deux heures à 37 degrés Celsius, avec secouer à 80 RPM. Retirer la bile de la solution de dispersion et la placer dans un tube de centrifugation séparé de 1,5 millilitre. Celui-ci contient les cellules dispersées.
Laver le tissu restant avec un millilitre de PBS, comme cela a été fait précédemment, et jeter le lavage PBS. Ajouter un millilitre de PBS au tissu restant et homogénéiser à cinq mètres par seconde, pendant 60 secondes. Diluer en série à la fois la solution de cellules dispersées et l’échantillon de tissu homogénéisé en piper 100 microlitres de l’échantillon dans 900 microlitres de PBS dans un tube à centrifuger de 1,5 millilitre.
Vortex de l’échantillon dilué et poursuivre la dilution cinq fois de plus pour un total de six dilutions. Plaque spot l’échantillon en piper 10 microlitres de chaque dilution sur la zone indiquée sur une plaque de gélose sélective. Comptez l’UFC et calculez le pourcentage de dispersion en divisant l’UFC dispersée par l’UFC totale et en multipliant par 100.
Dans cette expérience, huit à 10 souris femelles de Webster suisses de semaine ont été infectées par 10 à la quatrième UFC de PA01 portant le plasmide de luminescence PQF50-lux. On a permis à l’infection d’établir pendant 48 heures avant d’administrer trois traitements de 30 minutes de PBS comme contrôle de véhicule, ou de 10% GH comme traitement expérimental pour digérer l’EPS de biofilm. Dans la section A, les souris ont été essées avant le traitement, directement après le traitement et 10 et 20 heures après le traitement.
En utilisant IVIS, une infection établie peut être visualisée dans le lit de la plaie générant un signal bioluminescent lumineux. La dispersion des bactéries hors du lit de blessure peut être visualisée immédiatement après le traitement de GH, mais pas après le traitement de PBS. La dissémination bactérienne dans les organes peut également être vue en plaçant la souris sur le côté pour l’imagerie, comme indiqué dans les panneaux inférieurs.
Dans la section B, des images de souris traitées au PBS et au GH ont démontré une augmentation du signal luminescent 20 heures après le traitement, par rapport au prétraitement. Cependant, il est toujours important de quantifier l’UFC en raison du seuil de détection d’une luminescence dans IVIS. À 20 heures après le traitement, les souris ont été euthanasiées et les lits de plaies et les rates ont été recueillis pour dénombrer l’UFC par gramme de tissu.
La section C montre la charge bactérienne dans le lit de la plaie, tandis que la section D montre la charge bactérienne dans la rate. Ces données suggèrent une propagation disséminée des bactéries dispersées, puisque les bactéries n’ont été détectées que dans la rate des souris traitées avec la solution GH ciblant l’EPS. Bien que ces protocoles soient très utiles, il existe certaines limitations.
Tout d’abord, il convient de noter qu’il existe une limitation de détection avec le système d’imagerie in vivo, ou IVIS. Une diminution du signal luminescent peut être observée lorsque les bactéries entrent en phase stationnaire. Par conséquent, il est important de recueillir les tissus d’intérêt et de mesurer l’UFC présente, car il peut y avoir un décalage entre la luminescence et l’UFC énumérées.
Cependant, IVIS est utile pour visualiser l’efficacité du traitement tout au long d’une étude, sans avoir à euthanasier réellement l’animal. Une autre limite à prendre en considération est l’exigence d’une surveillance étroite des bandages. Les bandages sont nécessaires pour réduire la cicatrisation contractile ainsi que pour garder la plaie stérile des autres bactéries.
Les bandages devront être remplacés souvent, ce qui peut entraîner un débridement accidentel de la plaie et une possibilité de contamination. Ces protocoles décrivent des méthodes nouvelles pour étudier la bile de la dispersion, et l’évaluation de la bile thérapeutique des agents de dispersion. Ces modèles permettent le développement d’infections complexes associées au biofilm polymicrobial qui imitent les infections humaines cliniquement pertinentes.
Nous espérons que ces protocoles seront utilisés et affinés pour poursuivre le développement d’agents de dispersion anti-biofilm à usage thérapeutique.
