الورم الأرومي الشبكي البشري هو النوع الأكثر شيوعا من سرطان العين في مرحلة الطفولة. يصعب الحصول على عينات سريرية ولا يمكن لنماذج الفئران تشكيل الورم الأرومي الشبكي. لذلك ، يعد توليد الورم الأرومي الشبكي في المختبر ضروريا لمراقبة نشأة الورم الأرومي الشبكي وانتشاره ونموه ، ولتطوير عوامل علاجية جديدة.
يمكن أن تصل كفاءة هذا البروتوكول إلى حوالي 100٪ على الرغم من أن مدة توليد الورم الأرومي الشبكي متغيرة من اليوم 45 إلى اليوم 120. للحفاظ على الورم الأرومي الشبكي واحد أو RB واحد بالضربة القاضية الخلايا الجذعية الجنينية البشرية ، استزرع الجين تحرير خلايا H تسع خلايا في لوحة ستة بئر مغلفة بعامل نمو مصفوفة الغشاء القاعدي وتغيير الوسط كل يوم. لتمرير الخلايا ، احتضنها في مخزن EDTA المؤقت لمدة 3.5 دقيقة عند 37 درجة مئوية أو خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة.
استزرع الخلايا حتى تصل إلى 80٪ التقاء. بعد ذلك ، لبدء تمايز خلايا الشبكية ، قم بإزالة الوسط وشطف الخلايا بملليلتر واحد من DPBS. بعد ذلك ، قم برفع مستعمرات الخلايا عن طريق إضافة ملليلتر واحد من المخزن المؤقت Dispase والتحضين عند 37 درجة مئوية لمدة خمس دقائق.
مراقبة مستعمرات الخلية تحت المجهر. بمجرد أن تبدأ حواف المستعمرات في الظهور ، قم بشفط المخزن المؤقت Dispase وشطف الخلايا برفق مرة واحدة باستخدام ملليلتر واحد من DPBS. ثم أضف ملليلتر واحد من المتوسط إلى البئر وباستخدام طرف ماصة قياسي 10 ميكرولتر ، قم بتقطيع المستعمرات إلى قطع.
استخدم مكشطة الخلايا لكشط الخلايا المتبقية في الوسط. حصاد الخلايا عن طريق الطرد المركزي في أنبوب 15 ملليلتر. بعد الطرد المركزي ، اترك حوالي 50 ميكرولتر من المادة الطافية لتفريق الخلايا في الوسط.
ثم أضف 250 ميكرولتر من عامل النمو المخفض مصفوفة الغشاء القاعدي واخلطها عن طريق التحريض اللطيف. بعد الخلط ، ضع الأنبوب سعة 15 ملليلتر مع الخلايا المعلقة في حاضنة 37 درجة مئوية. بعد حضانة لمدة 20 دقيقة ، يجب أن تشكل الخلايا ومصفوفة الغشاء القاعدي المختزلة لعامل النمو هلاما صلبا.
بعد ذلك ، أضف ملليلتر واحد من المتوسط إلى الأنبوب سعة 15 ملليلتر. باستخدام ماصة ملليلتر واحد ، ماصة الجل المتصلب مرتين إلى ثلاث مرات لتفريق التكتل. ثم أضف تسعة ملليلتر أخرى من المتوسط وانقل معلق الخلية إلى طبق زراعة خلية 10 سم.
احتضان الطبق عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. يعتبر هذا اليوم صفر. في اليوم الأول ، افحص الخلايا باستخدام المجهر.
في المتوسط ، لوحظت ثلاثة إلى أربعة أكياس في قطعة واحدة من الهلام. في اليوم الخامس ، قم بتغيير الوسط عن طريق جمع المادة الطافية في أنبوب سعة 15 ملليلتر ، مما يسمح للأكياس بالاستقرار في القاع واستبدال المادة الطافية بأخرى متوسطة جديدة. قم بتفريق الخراجات في الأنبوب إلى طبقين بطول 10 سم ، مما يضمن 300 كيس على الأقل في كل طبق.
في اليوم السابع ، تنتشر معظم الخراجات المرتبطة بالطبق وتشكل مستعمرات ملتصقة. في اليوم 10 ، قم بتغيير الوسيط بوسط جديد ، مما يضمن بقاء جميع الخراجات متصلة بالطبق. راقب الخلايا تحت المجهر من الأيام 13 إلى 17 للتأكد من انتشار الخلايا.
في اليوم 15 ، بعد شطف الخلايا مرة واحدة مع ملليلتر واحد من DPBS ، أضف ملليلتر واحد من محلول Dispase واحتضانه عند 37 درجة مئوية. بعد خمس دقائق ، قم بإزالة المخزن المؤقت Dispase وشطف الثقافات برفق باستخدام ملليلتر واحد من DPBS. ثم أضف 10 ملليلتر من المتوسط الثاني إلى كل طبق 10 سم واحتضانه في حاضنة 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون.
بعد 24 ساعة ، تنفصل الثقافات الملتصقة تلقائيا وتتجمع في عضويات شبكية العين. بعد ثلاثة أيام من الانفصال ، اجمع الخلايا من طبق زراعة الخلايا في أنبوب سعة 15 ملليلتر. عندما تستقر الكائنات العضوية ، قم بإزالة المادة الطافية من الأنبوب وانقل المواد العضوية إلى طبق بتري جديد غير ملتصق مع 10 ملليلتر من المتوسط الثاني للأيام الأربعة التالية.
بعد أسبوع من الانفصال ، قم بتغيير المتوسط إلى المتوسط الثالث ومن هذا اليوم فصاعدا ، قم بزراعة المواد العضوية في الوسط الثالث. في اليوم 27 من ثقافة الشبكية العضوية ، تكون بنية الحويصلة البصرية واضحة وحوالي 90٪ من الكائنات العضوية تعرض هذا الهيكل. يحدث الكشف الأول عن الورم الأرومي الشبكي في اليوم 45 ويصبح واضحا في اليوم 50.
عندما ينمو إلى اليوم 90 ، يتم طي هياكل الحويصلة البصرية بشكل أساسي بواسطة الورم الأرومي الشبكي. يمكن الآن عزل الورم الأرومي الشبكي واستزراعه بشكل أكبر كخط خلوي. في اليوم 105 ، يتم تغليف أكثر من 80٪ من عضويات الشبكية بالكامل بالورم الأرومي الشبكي.
تعبر هذه الكائنات العضوية بشكل كبير عن علامة الانتشار Ki67 وعلامة الجين الورمي SYK مقارنة بعضويات الشبكية المشتقة من H تسعة ، مما يشير إلى تكوين الأورام. بالإضافة إلى ذلك ، يوضح التعبير العالي لعلامة السلائف المخروطية ARR3 وعلامة السلائف للمستقبلات الضوئية CRX في عضويات الورم الأرومي الشبكي أنها تنشأ من خلايا السلائف المخروطية. يتم تصوير النتائج الرديئة والمتفوقة خلال المراحل المورفولوجية الثلاث لتوليد الورم الأرومي الشبكي هنا.
يمكن تمييز الخلايا الجذعية الجنينية البشرية المتمايزة وغير المتمايزة بسهولة بناء على مورفولوجيتها. يتم اختيار الخلايا غير المتمايزة لتشكيل الورم الأرومي الشبكي. في اليوم الخامس ، يجب أن تكون الكرة المتولدة مجوفة وليست صلبة.
يشتق الورم الأرومي الشبكي من عضويات الشبكية التي تعرض بنية الحويصلة البصرية. لا يتم إنشاء الورم الأرومي الشبكي من الكائنات العضوية السفلية. أثناء تنفيذ الإجراء ، يجب تبريد جميع النصائح وإذابة مصفوفة الغشاء القاعدي عند أربع درجات قبل إضافتها إلى الأنبوب.
هذه خطوة أساسية لبروتوكول التمايز هذا.
