Il retinoblastoma umano è il tipo più comune di cancro intraoculare nell'infanzia. I campioni clinici sono difficili da ottenere e i modelli di topi non possono formare il retinoblastoma. Pertanto, la generazione di retinoblastoma in vitro è essenziale per osservare la genesi, la proliferazione e la crescita del retinoblastoma e per lo sviluppo di nuovi agenti terapeutici.
L'efficienza di questo protocollo può raggiungere circa il 100% anche se la durata per la generazione del retinoblastoma è variabile dal giorno 45 al giorno 120. Per il mantenimento del retinoblastoma uno o RB uno knockout cellule staminali embrionali umane, coltura il gene modificato H nove cellule in una piastra a sei pozzetti rivestita con fattore di crescita ridotto matrice di membrana basale e cambiare il terreno ogni giorno. Per far passare le cellule, incubarle in tampone EDTA per 3,5 minuti a 37 gradi Celsius o cinque minuti a temperatura ambiente.
Coltivare le cellule fino a raggiungere l'80%confluenza. Quindi, per iniziare la differenziazione delle cellule retiniche, rimuovere il mezzo e sciacquare le cellule con un millilitro di DPBS. Quindi, elevare le colonie cellulari aggiungendo un millilitro di tampone Dispase e incubare a 37 gradi Celsius per cinque minuti.
Osserva le colonie cellulari al microscopio. Una volta che i bordi delle colonie iniziano a stendersi, aspirare il tampone Dispase e sciacquare delicatamente le cellule una volta con un millilitro di DPBS. Quindi aggiungere un millilitro di uno medio nel pozzetto e utilizzando una punta di pipetta standard da 10 microlitri, tagliare le colonie a pezzi.
Utilizzare un raschietto cellulare per raschiare le cellule rimanenti nel mezzo. Raccogliere le cellule mediante centrifugazione in un tubo da 15 millilitri. Dopo la centrifugazione, lasciare circa 50 microlitri di surnatante per disperdere le cellule nel mezzo.
Quindi aggiungere 250 microlitri di matrice di membrana basale ridotta con fattore di crescita e mescolare agitando delicatamente. Dopo la miscelazione, posizionare il tubo da 15 millilitri con le celle sospese in un incubatore a 37 gradi Celsius. Dopo un'incubazione di 20 minuti, le cellule e la matrice di membrana basale ridotta dal fattore di crescita dovrebbero formare un gel solidificato.
Quindi, aggiungere un millilitro di medio al tubo da 15 millilitri. Utilizzando una pipetta da un millilitro, pipettare il gel solidificato due o tre volte per disperdere il grumo. Quindi aggiungere altri nove millilitri di uno medio e trasferire la sospensione cellulare in un piatto di coltura cellulare di 10 centimetri.
Incubare il piatto a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Questo è considerato il giorno zero. Il primo giorno, esamina le cellule usando un microscopio.
In media, si osservano da tre a quattro cisti in un pezzo di gel. Il quinto giorno, cambia il mezzo raccogliendo il surnatante in un tubo da 15 millilitri, permettendo alle cisti di depositarsi sul fondo e sostituendo il surnatante con uno medio fresco. Disperdere le cisti nel tubo in due piatti da 10 centimetri, assicurando almeno 300 cisti in ogni piatto.
Il settimo giorno, la maggior parte delle cisti attaccate al piatto si diffondono e formano colonie aderenti. Il giorno 10, cambia il mezzo con uno medio fresco, assicurandoti che tutte le cisti rimangano attaccate al piatto. Osservare le cellule al microscopio dai giorni 13 ai 17 per assicurarsi che le cellule si stiano diffondendo.
Il giorno 15, dopo aver risciacquato le cellule una volta con un millilitro di DPBS, aggiungere un millilitro di soluzione di Dispase e incubare a 37 gradi Celsius. Dopo cinque minuti, rimuovere il tampone Dispase e risciacquare delicatamente le colture con un millilitro di DPBS. Quindi aggiungere 10 millilitri di mezzo due a ciascun piatto da 10 centimetri e incubare in un incubatore a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica.
Dopo 24 ore, le colture aderenti si staccano spontaneamente e si assemblano in organoidi retinici. Tre giorni dopo il distacco, raccogliere le cellule dal piatto di coltura cellulare in un tubo da 15 millilitri. Quando gli organoidi si depositano, rimuovere il surnatante dal tubo e trasferire gli organoidi in una nuova capsula di Petri non aderente con 10 millilitri di mezzo due per i successivi quattro giorni.
Una settimana dopo il distacco, cambiare il mezzo in medio tre e da questo giorno in poi, coltivare gli organoidi in mezzo tre. Il giorno 27 della coltura di organoidi retinici, l'architettura della vescicola ottica è evidente e circa il 90% degli organoidi mostra questa struttura. La prima rilevazione del retinoblastoma avviene il giorno 45 e diventa palpabile il giorno 50.
Quando cresce fino al giorno 90, le strutture delle vescicole ottiche sono principalmente avvolte dal retinoblastoma. Il retinoblastoma può ora essere isolato e coltivato ulteriormente come linea cellulare. Il giorno 105, oltre l'80% degli organoidi retinici sono completamente avvolti dal retinoblastoma.
Questi organoidi esprimono altamente il marcatore di proliferazione Ki67 e il marcatore oncogene SYK rispetto agli organoidi retinici derivati da H nove, indicando la tumorigenesi. Inoltre, l'elevata espressione del marcatore precursore del cono ARR3 e del marcatore precursore dei fotorecettori CRX negli organoidi del retinoblastoma dimostra che provengono da cellule precursori dei coni. I risultati inferiori e superiori durante le tre fasi morfologiche della generazione del retinoblastoma sono rappresentati qui.
Le cellule staminali embrionali umane differenziate e indifferenziate possono essere facilmente distinte in base alla loro morfologia. Le cellule indifferenziate sono scelte per la formazione del retinoblastoma. Il quinto giorno, la sfera generata dovrebbe essere vuota piuttosto che solida.
Il retinoblastoma deriva dagli organoidi retinici che mostrano l'architettura delle vescicole ottiche. Nessun retinoblastoma viene generato dagli organoidi inferiori. Durante l'esecuzione della procedura, tutte le punte devono essere raffreddate e la matrice della membrana basale deve essere fusa a quattro gradi prima di aggiungerla nel tubo.
Questo è un passo fondamentale per questo protocollo di differenziazione.
