인간 망막 모세포종은 어린 시절에 가장 흔한 유형의 안구 암입니다. 임상 샘플을 얻기가 어렵고 마우스 모델은 망막 모세포종을 형성 할 수 없습니다. 따라서 체외 망막 모세포종 생성은 망막 모세포종의 발생, 증식 및 성장을 관찰하고 새로운 치료제를 개발하는 데 필수적입니다.
이 프로토콜의 효율성은 망막 모세포종 생성 기간이 45 일에서 120 일까지 다양하지만 약 100 %에 도달 할 수 있습니다. 망막모세포종 1 또는 RB1 녹아웃 인간 배아 줄기세포의 유지를 위해, 성장인자 감소 기저막 매트릭스로 코팅된 6웰 플레이트에서 편집된 H9 유전자를 배양하고 배지를 매일 교체하였다. 세포를 계대하려면 EDTA 완충액에서 섭씨 37도에서 3.5분 또는 실온에서 5분 동안 배양합니다.
세포가 80% 합류에 도달할 때까지 배양합니다. 그런 다음 망막 세포 분화를 시작하려면 배지를 제거하고 1 밀리리터의 DPBS로 세포를 헹굽니다. 다음으로, 1 밀리리터의 Dispase 완충액을 추가하고 섭씨 37도에서 5 분 동안 배양하여 세포 콜로니를 높입니다.
현미경으로 세포 콜로니를 관찰하십시오. 콜로니의 가장자리가 굴러 나오기 시작하면 Dispase 버퍼를 흡인하고 1 밀리리터의 DPBS로 세포를 부드럽게 헹굽니다. 그런 다음 1 밀리리터의 중간 크기를 우물에 넣고 10 마이크로 리터 표준 피펫 팁을 사용하여 콜로니를 조각으로 자릅니다.
세포 스크레이퍼를 사용하여 배지에 남아 있는 세포를 긁어냅니다. 15 밀리리터 튜브에서 원심 분리로 세포를 수확합니다. 원심분리 후 약 50 마이크로 리터의 상청액을 남겨 배지에 세포를 분산시킵니다.
그런 다음 250 마이크로 리터의 성장 인자 감소 기저막 매트릭스를 추가하고 부드러운 교반으로 혼합합니다. 혼합 후 부유 세포가있는 15 밀리리터 튜브를 섭씨 37도 인큐베이터에 넣습니다. 20분 배양 후, 세포 및 성장 인자 감소 기저막 매트릭스는 응고된 겔을 형성해야 한다.
다음으로 15 밀리리터 튜브에 1 밀리리터의 중간 1 밀리리터를 첨가하십시오. 1 밀리리터 피펫을 사용하여, 응고된 겔을 2 내지 3회 피펫팅하여 덩어리를 분산시킨다. 그런 다음 9 밀리리터의 배지를 추가하고 세포 현탁액을 10cm 세포 배양 접시에 옮깁니다.
접시를 섭씨 37도 및 5%이산화탄소에서 배양합니다. 이것은 0 일로 간주됩니다. 첫날에는 현미경을 사용하여 세포를 검사합니다.
평균적으로 3-4 개의 낭종이 한 조각의 젤에서 관찰됩니다. 5 일째에 상청액을 15 밀리리터 튜브에 모아 배지를 변경하여 낭종이 바닥에 침전되도록하고 상청액을 새로운 배지로 교체하십시오. 튜브의 낭종을 두 개의 10 센티미터 접시에 분산시켜 각 접시에 최소 300 개의 낭종을 확보하십시오.
일곱째 날에는 접시에 붙어있는 대부분의 낭종이 퍼져 부착 된 식민지를 형성합니다. 10 일째에 신선한 배지로 배지를 교체하여 모든 낭종이 접시에 붙어 있는지 확인하십시오. 13 일부터 17 일까지 현미경으로 세포를 관찰하여 세포가 퍼지고 있는지 확인하십시오.
15일째에 DPBS 1밀리리터로 세포를 한 번 헹군 후 1밀리리터의 Dispase 용액을 넣고 섭씨 37도에서 배양합니다. 5분 후, Dispase 완충액을 제거하고 1밀리리터의 DPBS로 배양물을 부드럽게 헹굽니다. 그런 다음 각 10cm 접시에 10 밀리리터의 중간 2 개를 넣고 섭씨 37도 및 5 % 이산화탄소 인큐베이터에서 배양하십시오.
24 시간 후, 부착 된 배양 물은 자발적으로 분리되어 망막 유기체로 조립됩니다. 분리 3 일 후, 15 밀리리터 튜브의 세포 배양 접시에서 세포를 수집하십시오. 오가노이드가 침전되면 튜브에서 상청액을 제거하고 오가노이드를 다음 4일 동안 배지 2 10밀리리터가 있는 새로운 비부착성 페트리 접시로 옮깁니다.
분리 일주일 후 배지를 배지 3으로 변경하고 오늘부터 배지 3에서 오가노이드를 배양합니다. 망막 오가노이드 배양 27일째에 시신경 소포 구조가 분명하며 약 90%의 오가노이드가 이 구조를 나타냅니다. 망막 모세포종의 첫 번째 발견은 45 일에 발생하며 50 일에 만져집니다.
90 일까지 성장하면 시신경 소포 구조가 주로 망막 모세포종에 의해 둘러싸여 있습니다. 망막 모세포종은 이제 세포주로 분리되고 추가로 배양 될 수 있습니다. 105일째에 망막 오가노이드의 80% 이상이 망막 모세포종에 완전히 둘러싸여 있습니다.
이들 오가노이드는 H9 유래 망막 오가노이드에 비해 증식 마커 Ki67 및 종양유전자 마커 SYK를 고도로 발현하며, 이는 종양 발생을 나타낸다. 추가적으로, 망막 모세포종 오가노이드에서 원뿔 전구체 마커 ARR3 및 광수용체 전구체 마커 CRX의 높은 발현은 이들이 원뿔 전구체 세포로부터 유래한다는 것을 입증한다. 망막 모세포종 생성의 세 가지 형태 학적 단계 동안 열등하고 우수한 결과가 여기에 묘사되어 있습니다.
분화된 인간 배아 줄기세포와 미분화된 인간 배아 줄기세포는 그 형태에 따라 쉽게 구별할 수 있다. 미분화 세포는 망막 모세포종 형성을 위해 선택됩니다. 5일째에 생성된 구는 단색이 아닌 속이 비어 있어야 합니다.
망막 모세포종은 시신경 소포 구조를 나타내는 망막 오가노이드에서 파생됩니다. 하부 유기체에서 망막 모세포종이 생성되지 않습니다. 절차를 수행하는 동안 모든 팁을 냉각하고 기저막 매트릭스를 튜브에 추가하기 전에 4도에서 녹여야합니다.
이것은 이 차별화 프로토콜의 핵심 단계입니다.
