Ретинобластома человека является наиболее распространенным типом внутриглазного рака в детском возрасте. Клинические образцы трудно получить, и мышиные модели не могут сформировать ретинобластому. Таким образом, генерация ретинобластомы in vitro необходима для наблюдения за генезисомой, пролиферации и роста ретинобластомы, а также для разработки новых терапевтических агентов.
Эффективность этого протокола может достигать около 100%, хотя продолжительность генерации ретинобластомы варьируется с 45-го по 120-й день. Для поддержания ретинобластомы одной или RB одной нокаутирующей эмбриональной стволовой клетки человека культивируют ген отредактированной H девятью клетками в шести хорошо покрытых фактором роста уменьшенной базальной мембранной матрице и меняют среду каждый день. Для прохождения клеток инкубируют их в буфере ЭДТА в течение 3,5 минут при 37 градусах Цельсия или пяти минут при комнатной температуре.
Культивируйте клетки до тех пор, пока они не достигнут 80% слияния. Затем, чтобы инициировать дифференцировку клеток сетчатки, удалите среду и промойте клетки одним миллилитром DPBS. Затем поднимите колонии клеток, добавив один миллилитр буфера Диспазы и инкубируя при 37 градусах Цельсия в течение пяти минут.
Понаблюдайте за колониями клеток под микроскопом. Как только края колоний начнут раскатываться, аспирируйте буфер Dispase и осторожно промойте клетки один раз одним миллилитром DPBS. Затем добавьте в лунку один миллилитр среднего и, используя стандартный наконечник пипетки объемом 10 микролитров, разрежьте колонии на кусочки.
Используйте скребок для клеток, чтобы соскоблить оставшиеся ячейки в среде. Соберите клетки путем центрифугирования в 15-миллилитровой трубке. После центрифугирования оставьте около 50 микролитров супернатанта для диспергирования клеток в среде.
Затем добавляют 250 микролитров фактора роста с уменьшенной базальной мембранной матрицей и перемешивают путем мягкого перемешивания. После смешивания поместите 15-миллилитровую трубку со взвешенными клетками в инкубатор с температурой 37 градусов Цельсия. После 20-минутной инкубации клетки и фактор роста уменьшенной базальной мембранной матрицы должны образовать затвердевший гель.
Затем добавьте один миллилитр среднего в 15-миллилитрную трубку. Используя одну миллилитровую пипетку, пипетку затвердевают гелем два-три раза, чтобы рассеять комок. Затем добавляют еще девять миллилитров среднего и перекладывают клеточную суспензию в 10-сантиметровую чашку для культивирования клеток.
Инкубируйте блюдо при 37 градусах Цельсия и 5% углекислого газа. Это считается нулевым днем. В первый день исследуйте клетки с помощью микроскопа.
В среднем в одном куске геля наблюдается три-четыре кисты. На пятый день измените среду, собрав супернатант в 15-миллилитровую трубку, позволив цистам осесть на дне и заменив супернатант свежим средним. Рассейте цисты в трубке на две 10-сантиметровые чашки, обеспечив не менее 300 цист в каждой посуде.
На седьмой день большинство кист, прикрепленных к блюду, распространяются и образуют прилипшие колонии. На 10-й день замените среду на свежую, следя за тем, чтобы все кисты оставались прикрепленными к блюду. Наблюдайте за клетками под микроскопом с 13 по 17 день, чтобы убедиться, что клетки распространяются.
На 15-й день, после однократного промывания клеток одним миллилитром DPBS, добавляют один миллилитр раствора диспазы и инкубируют при 37 градусах Цельсия. Через пять минут удалите буфер Dispase и аккуратно промойте культуры одним миллилитром DPBS. Затем добавьте 10 миллилитров среднего по два на каждую 10-сантиметровую чашку и высиживают в инкубаторе 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа.
Через 24 часа адгезивные культуры спонтанно отделяются и собираются в органоиды сетчатки. Через три дня после отслоения соберите клетки из чашки для культивирования клеток в 15-миллилитровую трубку. Когда органоиды осядут, удалите супернатант из трубки и перенесите органоиды в новую неадгезивную чашку Петри с 10 миллилитрами среды два в течение следующих четырех дней.
Через неделю после отслоения измените среднюю на среднюю три и с этого дня культивируйте органоиды в среднюю тройку. На 27-й день культуры органоидов сетчатки архитектура зрительных пузырьков очевидна, и около 90% органоидов демонстрируют эту структуру. Первое обнаружение ретинобластомы происходит на 45 день и становится пальпируемым на 50 день.
Когда он растет до 90-го дня, структуры зрительных пузырьков в основном сворачиваются ретинобластомой. Ретинобластому теперь можно выделить и культивировать дальше как клеточную линию. На 105-й день более 80% органоидов сетчатки полностью окутаны ретинобластомой.
Эти органоиды высоко экспрессируют маркер пролиферации Ki67 и онкогенный маркер SYK по сравнению с H девятью производными органоидами сетчатки, что указывает на опухолевый генез. Кроме того, высокая экспрессия маркера-предшественника конуса ARR3 и маркера предшественника фоторецептора CRX в органоидах ретинобластомы демонстрирует, что они происходят из клеток-предшественников конуса. Здесь показаны худшие и высшие результаты на трех морфологических стадиях генерации ретинобластомы.
Дифференцированные и недифференцированные эмбриональные стволовые клетки человека можно легко отличить по их морфологии. Недифференцированные клетки выбираются для образования ретинобластомы. На пятый день генерируемая сфера должна быть полой, а не твердой.
Ретинобластома получена из органоидов сетчатки, которые демонстрируют архитектуру зрительных пузырьков. Ретинобластома не образуется из нижних органоидов. Во время выполнения процедуры все наконечники должны быть охлаждены, а матрица базальной мембраны должна быть расплавлена на четыре градуса перед добавлением ее в трубку.
Это ключевой шаг для этого протокола дифференциации.
