O retinoblastoma humano é o tipo mais comum de câncer intraocular na infância. Amostras clínicas são difíceis de obter e modelos de camundongos não podem formar o retinoblastoma. Portanto, a geração de retinoblastoma in vitro é essencial para observar a gênese, proliferação e crescimento do retinoblastoma e para o desenvolvimento de novos agentes terapêuticos.
A eficiência deste protocolo pode chegar a cerca de 100%, embora a duração da geração de retinoblastoma seja variável do dia 45 ao dia 120. Para a manutenção do retinoblastoma um ou RB um knockout células-tronco embrionárias humanas, cultura do gene editado H nove células em uma placa de seis poços revestida com fator de crescimento reduziu a matriz da membrana basal e mudar o meio todos os dias. Para passar as células, incube-as em tampão EDTA por 3,5 minutos a 37 graus Celsius ou cinco minutos à temperatura ambiente.
Proteja as células até atingirem 80% de confluência. Em seguida, para iniciar a diferenciação das células da retina, remova o meio e enxágue as células com um mililitro de DPBS. Em seguida, eleve as colônias celulares adicionando um mililitro de tampão Dispase e incubando a 37 graus Celsius por cinco minutos.
Observe as colônias celulares sob um microscópio. Uma vez que as bordas das colônias comecem a rolar, aspirar o tampão Dispase e enxaguar suavemente as células uma vez com um mililitro de DPBS. Em seguida, adicione um mililitro de meio no poço e, usando uma ponta de pipeta padrão de 10 microlitros, corte as colônias em pedaços.
Use um raspador de células para raspar as células restantes no meio. Colha as células por centrifugação em um tubo de 15 mililitros. Após a centrifugação, deixe cerca de 50 microlitros do sobrenadante para dispersar as células no meio.
Em seguida, adicione 250 microlitros de matriz de membrana basal reduzida com fator de crescimento e misture por agitação suave. Após a mistura, coloque o tubo de 15 mililitros com as células suspensas em uma incubadora de 37 graus Celsius. Após uma incubação de 20 minutos, as células e a matriz de membrana basal reduzida do fator de crescimento devem formar um gel solidificado.
Em seguida, adicione um mililitro de um médio ao tubo de 15 mililitros. Usando uma pipeta de um mililitro, pipete o gel solidificado duas a três vezes para dispersar o aglomerado. Em seguida, adicione mais nove mililitros de meio um e transfira a suspensão celular para um prato de cultura celular de 10 centímetros.
Incubar o prato a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Isso é considerado dia zero. No primeiro dia, examine as células usando um microscópio.
Em média, três a quatro cistos são observados em um pedaço de gel. No quinto dia, mude o meio coletando o sobrenadante em um tubo de 15 mililitros, permitindo que os cistos se depositem no fundo e substituindo o sobrenadante por um meio fresco. Disperse os cistos no tubo em duas placas de 10 centímetros, garantindo pelo menos 300 cistos em cada prato.
No sétimo dia, a maioria dos cistos ligados ao prato se espalha e forma colônias aderentes. No dia 10, troque o meio por meio fresco um, garantindo que todos os cistos permaneçam presos ao prato. Observe as células sob um microscópio dos dias 13 a 17 para garantir que as células estejam se espalhando.
No dia 15, depois de enxaguar as células uma vez com um mililitro de DPBS, adicione um mililitro de solução de Dispase e incube a 37 graus Celsius. Após cinco minutos, retire o tampão Dispase e lave suavemente as culturas com um mililitro de DPBS. Em seguida, adicione 10 mililitros de meio dois a cada prato de 10 centímetros e incube em uma incubadora de 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono.
Após 24 horas, as culturas aderentes se desprendem espontaneamente e se reúnem em organoides da retina. Três dias após o descolamento, colete as células do prato de cultura celular em um tubo de 15 mililitros. Quando os organoides se instalarem, remova o sobrenadante do tubo e transfira os organoides para uma nova placa de Petri não aderente com 10 mililitros de meio dois nos quatro dias seguintes.
Uma semana após o descolamento, mude o meio para o meio três e, a partir deste dia, cultive os organoides no meio três. No dia 27 da cultura organoide da retina, a arquitetura da vesícula óptica é evidente e cerca de 90% dos organoides exibem essa estrutura. A primeira detecção do retinoblastoma ocorre no dia 45 e torna-se palpável no dia 50.
Quando cresce até o dia 90, as estruturas da vesícula óptica são principalmente envolvidas pelo retinoblastoma. O retinoblastoma pode agora ser isolado e cultivado ainda mais como uma linhagem celular. No dia 105, mais de 80% dos organoides da retina estão totalmente envolvidos pelo retinoblastoma.
Esses organoides expressam altamente o marcador de proliferação Ki67 e o marcador oncogênico SYK em comparação com os organoides retinianos derivados de H nove, indicando tumorigênese. Além disso, a alta expressão do marcador precursor do cone ARR3 e do marcador precursor fotorreceptor CRX nos organoides do retinoblastoma demonstra que eles se originam de células precursoras do cone. Resultados inferiores e superiores durante os três estágios morfológicos da geração do retinoblastoma são descritos aqui.
Células-tronco embrionárias humanas diferenciadas e indiferenciadas podem ser facilmente distinguidas com base em sua morfologia. As células indiferenciadas são escolhidas para a formação de retinoblastoma. No quinto dia, a esfera gerada deve ser oca em vez de sólida.
O retinoblastoma é derivado dos organoides da retina que exibem arquitetura de vesícula óptica. Nenhum retinoblastoma é gerado a partir dos organoides inferiores. Durante a realização do procedimento, todas as pontas devem ser resfriadas e a matriz da membrana basal deve ser derretida a quatro graus antes de adicioná-la ao tubo.
Este é um passo fundamental para este protocolo de diferenciação.
