ヒト網膜芽細胞腫は、小児期の最も一般的なタイプの眼内癌です。臨床サンプルの入手は困難であり、マウスモデルは網膜芽細胞腫を形成することができません。したがって、網膜芽細胞腫の発生、増殖、増殖を観察し、新規治療薬を開発するためには、in vitro網膜芽細胞腫の発生が不可欠です。
このプロトコルの効率は約100%に達する可能性がありますが、網膜芽細胞腫の発生期間は45日目から120日目までさまざまです。網膜芽細胞腫一またはRB一ノックアウトヒト胚性幹細胞の維持のために、遺伝子編集したH9細胞を増殖因子低減基底膜マトリックスでコーティングした6ウェルプレートで培養し、培地を毎日交換する。細胞を継代するには、EDTAバッファー中で摂氏37度で3.5分間、または室温で5分間インキュベートします。
80%コンフルエントに達するまで細胞を培養します。次に、網膜細胞の分化を開始するために、培地を取り出し、1ミリリットルのDPBSで細胞をすすぎます。次に、1ミリリットルのディスパーゼバッファーを添加し、摂氏37度で5分間インキュベートすることにより、細胞コロニーを上昇させます。
細胞コロニーを顕微鏡で観察する。コロニーの端がロールアウトし始めたら、ディスパーゼバッファーを吸引し、1ミリリットルのDPBSで細胞を1回穏やかにすすぎます。次に、1ミリリットルの培地をウェルに加え、10マイクロリットルの標準ピペットチップを使用して、コロニーを細かく切ります。
セルスクレーパーを使用して、培地中の残りの細胞をこすり落とします。15ミリリットルのチューブで遠心分離して細胞を回収します。遠心分離後、約50マイクロリットルの上清を残して、細胞を培地中に分散させます。
次に、250マイクロリットルの成長因子低減基底膜マトリックスを加え、穏やかに攪拌して混合します。混合後、懸濁した細胞を入れた15ミリリットルのチューブを摂氏37度のインキュベーターに入れます。20分間のインキュベーションの後、細胞および成長因子還元基底膜マトリックスは固化したゲルを形成するはずである。
次に、1ミリリットルの中型1個を15ミリリットルのチューブに加えます。1ミリリットルのピペットを用いて、固化したゲルを2〜3回ピペットで固め、塊を分散させた。次に、さらに9ミリリットルの培地1を加え、細胞懸濁液を10センチメートルの細胞培養皿に移します。
摂氏37度と5%二酸化炭素で皿をインキュベートします。これはゼロ日目と見なされます。初日に、顕微鏡を使用して細胞を調べます。
平均して、1枚のゲルに3〜4個の嚢胞が観察されます。5日目に、上清を15ミリリットルのチューブに集めて培地を交換し、嚢胞を底に定着させ、上清を新しい培地と交換します。チューブ内の嚢胞を2つの10センチメートル皿に分散させ、各皿に少なくとも300個の嚢胞を確保する。
7日目に、皿に付着したほとんどの嚢胞が広がり、付着性コロニーを形成した。10日目に、培地を新鮮な培地で交換し、すべての嚢胞が皿に付着したままであることを確認します。13日目から17日目まで顕微鏡で細胞を観察し、細胞が広がっていることを確認します。
15日目に、1ミリリットルのDPBSで細胞を1回すすぎた後、1ミリリットルのディスパーゼ溶液を加え、摂氏37度でインキュベートします。5分後、ディスパーゼバッファーを取り出し、1ミリリットルのDPBSで培養物を静かにすすぎます。次に、各10センチメートルの皿に10ミリリットルの培地2を加え、摂氏37度と5%の二酸化炭素インキュベーターでインキュベートします。
24時間後、付着培養物は自発的に剥離し、網膜オルガノイドに集合する。剥離の3日後に、細胞培養皿から細胞を15ミリリットルのチューブに集める。オルガノイドが落ち着いたら、チューブから上清を取り除き、次の4日間、10ミリリットルの培地2を含む新しい非付着性ペトリ皿にオルガノイドを移します。
剥離の1週間後、培地を培地3に変更し、この日以降は培地3でオルガノイドを培養します。網膜オルガノイド培養の27日目には、視神経小胞構造が明らかであり、オルガノイドの約90%がこの構造を示しています。網膜芽細胞腫の最初の検出は45日目に起こり、50日目に触知可能になります。
それが90日目に成長すると、視神経小胞構造は主に網膜芽細胞腫によって包まれる。網膜芽細胞腫を単離し、細胞株としてさらに培養することができます。105日目には、網膜オルガノイドの80%以上が網膜芽細胞腫に完全に包まれています。
これらのオルガノイドは、Hナイン由来の網膜オルガノイドと比較して、増殖マーカーKi67および癌遺伝子マーカーSYKを高発現しており、腫瘍形成を示している。さらに、網膜芽細胞腫オルガノイドにおける錐体前駆体マーカーARR3および視細胞前駆体マーカーCRXの高発現は、それらが錐体前駆細胞に由来することを実証する。網膜芽細胞腫発生の3つの形態学的段階における劣った結果と優れた結果がここに描かれています。
分化したヒト胚性幹細胞と未分化なヒト胚性幹細胞は、その形態に基づいて容易に区別することができる。未分化細胞は網膜芽細胞腫形成のために選択される。5日目には、生成される球は中実ではなく中空である必要があります。
網膜芽細胞腫は、視神経小胞構造を示す網膜オルガノイドに由来します。下オルガノイドから網膜芽細胞腫は発生しません。手順を実行している間、すべての先端を冷却し、基底膜マトリックスを4度で溶かしてからチューブに追加する必要があります。
これは、この分化プロトコルの重要なステップです。
