Transiente Transaktion der strobazierten Formen von Echinococcus granulosus. Wir beschreiben eine schnelle transiente Transduktionstechnik in verschiedenen Entwicklungsstadien von Echinococcus granulosus unter Verwendung von lentiviralen Vektoren der dritten Generation. Die zystische Echinokokkose oder Hydatiden-Krankheit ist eine der wichtigsten zoonotischen parasitären Erkrankungen, die durch Echinococcus granulosus, einen kleinen Bandwurm, der im Darm von Hunden untergebracht ist, verursacht wird.
Es besteht ein dringender Bedarf an angewandter genetischer Forschung, um die Mechanismen der Pathogenese und der Krankheitsbekämpfung und -prävention zu verstehen. Das Fehlen eines effektiven Genbewertungssystems behindert jedoch die direkte Interpretation der funktionellen Genetik von Cestodenparasiten, einschließlich Echinococcus-Arten. Fortschritte beim Gentransfer bei parasitären Plattwürmern sind im Vergleich zu Protozoenparasiten noch begrenzt.
Der Einsatz von viralen Abgabesystemen hat sich in den letzten zwei Jahrzehnten zu einem wesentlichen Werkzeug für die Transgenabgabe und Gen- / Proteinuntersuchung entwickelt. Also untersuchten wir die lentivirale transiente Transduktion des GFP-Reportergens zu den Protoscoleces und strobilierten Würmern von Echinococcus granulosus. Abbildung 1 zeigt eine schematische Darstellung des Studienprotokolls für Echinococcus granulosus-Stadien.
Eine, die Hydatidenzysten sammelt. Sammeln Sie Leberhydatidenzysten von natürlich infizierten Schafen, die routinemäßig in einem Schlachthof geschlachtet werden. Sterilisieren Sie die Zystenoberfläche vollständig mit steriler Gaze und 70% Alkohol, bevor Sie die Protoscoleces absaugen.
Saugen Sie 20 bis 50 ml Hydatidenflüssigkeit in sterile 50 ml konische Röhrchen ab. Nach dem Abtropfen die Zyste mit einer scharfen Klinge austupfen, die Keimschicht in einen sterilen 50 ml konischen Schlauch überführen und für kurze Zeit schütteln, um die Ansammlung von Protoscoleces zu erhöhen. Waschen Sie die Protoscoleces drei- bis fünfmal mit PBS-Puffer.
Beobachten Sie die Protoscoleces in 0,1% Eosin fünf Minuten lang, um die Lebensfähigkeit der Protoscoleces unter einem Lichtmikroskop zu bestimmen. Verwenden Sie Protoscoleces mit einer Lebensfähigkeit von mindestens 95% für die Kultur. Behandeln Sie den Protoscoleces-Niederschlag mit zwei ml Pepsin für 15 bis 20 Minuten.
Um einzelne Protoscoleces zu isolieren, suspendieren Sie das Protoscoleces-Sediment in PBS und leiten Sie es durch zwei Schichten steriler Gaze in ein neues steriles 50 ml konisches Röhrchen. Zweitens, biphasische Kultivierung von Protoscoleces von Echinococcus granulosus, um erwachsene Würmer zu erhalten. Fügen Sie 10 ml des flüssigen Phasenmediums zu jedem 25 Quadratzentimeter großen Kulturkolben hinzu.
Etwa 5.000 Protoscoleces in den Kulturkolben geben und in den CO2-Inkubator überführen. Nach 24 bis 48 Stunden die Protoscoleces in einen neuen Kolben mit der festen Phase überführen und einen ml des gleichen frischen flüssigen Phasenmediums pro Kolben hinzufügen. Die Kolben in den Inkubator geben, 37 Grad Celsius, 5% CO2.
Ersetzen Sie das Medium alle fünf bis sieben Tage durch frisches flüssiges Phasenmedium. Drei, monophasische Kultivierung von Protoscoleces eines Echinococcus granulosus. Stellen Sie sicher, dass die monophasische Kultivierung 24 bis 48 Stunden vor der Transduktion durchgeführt wird.
Kultur etwa 5.000 Protoscoleces in einem 25 Zentimeter großen quadratischen Kulturkolben mit RPMI und 10% FBS. Überführen Sie die Kolben bis zur Verwendung in den CO2-Inkubator. Viertens, Zellkultur für die Virusproduktion und -vorbereitung.
Übertragen Sie 500.000 HEK-Zellen in einen 25 Zentimeter großen quadratischen Kolben, der 5 ml DMEM mit 10% FBS, 100 U / ml Penicillin und 100 Mikrogramm / ml Streptomycin enthält. Inkubieren Sie die HEK2-Zellen bei 37 Grad Celsius in 5%CO2 und passieren Sie sie alle 48 Stunden im kompletten Kulturmedium. Verwenden Sie schließlich Low-Passage-HEK-Zellen für die Transduktion.
Fünftens, Produktion und Präparation des Virus mit den lentiviralen Vektoren der dritten Generation. Tag eins, nach der Trypsinisierung der HEK-Zellen in einer 6-Well-Kulturplatte, Samen Sie 70.000 Zellen pro Well mit frischem antibiotikafreiem DMEM mit 10% FBS. Verwenden Sie Zellen mit einer Konfluenz von 50 bis 60% für die Transduktion durch die Calciumphosphatmethode.
Ersetzen Sie am zweiten Tag das Zellkulturmedium zwei bis drei Stunden vor dem Experiment durch frisches, antibiotikafreies DMEM, das 2% FBS enthält. Mischen Sie in einem 1,5-ml-Röhrchen lentivirale Plasmide der dritten Generation, einschließlich 7 Mikrogramm / Mikroliter pCDH513b-Transfervektor, 4 Mikrogramm / Mikroliter PLPII, 4 Mikrogramm / Mikroliter PLPI und 2 Mikrogramm / Mikroliter PMD2G-Hilfsvektoren. Fügen Sie der Mischung HEPES-Puffer hinzu, um das Volumen von 422 Mikrolitern zu erreichen.
Fügen Sie 16 Mikroliter 1% TE-Puffer zu der Mischung hinzu. Fügen Sie 62 Mikroliter 2,5 ml Calciumchlorid in die Röhrchen hinzu und mischen Sie gut. Fügen Sie 500 Mikroliter 2x HBS-Puffer zu der Mischung hinzu, tropfenweise innerhalb von ein bis zwei Minuten mit einer Pasteur-Pipette.
Vorsichtig mischen, bis eine halbundurchsichtige Lösung erhalten ist, und die Mischung 20 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubieren. Am Ende fügen Sie die Mischung langsam zu jeder Platte hinzu und verteilen Sie sie mit langsamen kreisenden Bewegungen. Inkubieren Sie die Platten bei 37 Grad Celsius in einem 5%CO2-Inkubator und ersetzen Sie das Medium nach vier bis sechs Stunden durch antibiotikafreies DMEM, das 10% FBS enthält.
Bestätigen Sie am dritten Tag die erfolgreiche transiente Transduktion und Zelllebensfähigkeit mit einem inversen Fluoreszenzmikroskop. Am vierten Tag ernten Sie Viren aus dem Kulturmedium, indem Sie den Überstand jedes Brunnens sammeln und bis zur Verwendung bei negativen 70 Grad Celsius lagern. Sechs, transiente Transduktion verschiedener Stadien von Echinococcus granulosus mit dem Virus.
Verwenden Sie am ersten Tag eine 12-Well-Kulturplatte für den Gentransfer. Kultur 5.000 bis 50.000 HEK-Zellen in Triplikaten mit einem vollständigen DMEM-Medium als interne Referenz. Kultur 150 frische Protoscoleces in dreifacher Ausführung in RPMI und 10%FBS.
Kultur 30 strobilierte Würmer in dreifacher Ausfertigung in DMEM und 10%-hitzeinaktiviertes FBS. Bereiten Sie eine Mischung aus 1 Million Viren mit vier Mikrogramm / ml Transfektionsreagenz vor, um die HEK-Zellen und verschiedene Stadien des Wurms zu transduzieren. Fügen Sie die Mischung langsam zu jeder Platte hinzu und verteilen Sie sie mit langsamen kreisenden Bewegungen.
Inkubieren Sie die Platten für vier bis sechs Stunden in einem CO2-Inkubator, 37 Grad Celsius, 5% CO2. Ersetzen Sie das Medium für jede Probe durch das gleiche vollständige Kulturmedium, um die toxischen Wirkungen der Transfektionsreagenzien zu minimieren. Wiederholen Sie am zweiten Tag zwei vorherige Schritte, um die Effizienz der transienten Transduktion für die HEK-Zellen, Protoscoleces und strobilierten Würmer zu erhöhen.
Inkubieren Sie alle Platten für 24 bis 48 Stunden in einem CO2-Inkubator mit den gleichen Kulturbedingungen, basierend auf der Art des Zellmediums. Stellen Sie am dritten Tag sicher, dass die Transduktion erfolgreich ist, indem Sie die Fluoreszenzmikroskopie verwenden. Repräsentative Ergebnisse.
Hier beschreiben wir eine schnelle und effiziente transiente Transduktionstechnik in Echinococcus granulosus unter Verwendung von lentiviralen Vektoren der dritten Generation. Wir kultivierten Protoscoleces in biphasischen Kulturmedien, um nach unseren früheren Studien strobilierte Würmer zu erhalten. Protoscoleces werden nach einer sechswöchigen In-vitro-Kultur zu den strobilierten Würmern entwickelt.
Verschiedene Stadien von Echinococcus granulosus wurden im biphasischen Kulturmedium beobachtet, einschließlich invaginater Protoscoleces, Abbildung 2A, evaginater Protoscoleces, Abbildung 2B und strobilierter Würmer mit erster und dritter Proglottidenbildung, Abbildung 2C bis E. Protoscoleces und die aus monophasischen bzw. biphasischen Kultivierungen erhaltenen strobilierten Würmer wurden durch GFP-exprimierende Lentiviren transfiziert, Abbildung 3. HEK-Zellen exprimieren eindeutig GFP als transiente Transduktionsprozesskontrolle. Die erwachsenen Würmer drückten GFP am deutlichsten in der tegumentalen Schicht aus.
Protoscoleces haben jedoch nach 48 Stunden eine etwas geringere GFP-Expression gezeigt. Einige Zystenflüssigkeitsrückstände und / oder Keimschichtablagerungen um die Protoscoleces verursachten einen gewissen Fluoreszenzhintergrund in den transfizierten Proben. Die Intensität der Fluoreszenz in HEK-Zellen und strobilierten Würmern nahm nach 24 und 48 Stunden zu.
Das Verständnis der molekularen Grundlagen von Nematoden und der Platyhelminthes-Biologie ist eine der wichtigsten Grenzen in der Pathogenität zoonotischer Parasiten. Das Fehlen eines effektiven Genbewertungssystems ist ein großes Hindernis für die direkte Interpretation der funktionellen Genetik von Cestodparasiten, einschließlich Echinococcus-Arten. Das Hauptziel dieser Arbeit war es, den Prozess der lentiviralen Vektortransduktion zu veranschaulichen, der in der zukünftigen Echinokokkose-Forschung von entscheidender Bedeutung sein wird.
Die Ergebnisse zeigen, dass strobilisierte Würmer besser auf die transiente Transduktion des Gens ansprechen als die Protoscoleces, was das Ergebnis einer ausgedehnten tegumentalen Struktur in den strobazierten Formen sein kann. Aufgrund der Natur der lentiviralen Transduktion ist die Fluoreszenzintensität in den multizellulären Protoscoleces und strobierten Würmern jedoch typischerweise viel niedriger als in einschichtigen HEK-Zellen. Es besteht ein dringender Bedarf an angewandter genetischer Forschung auf genomischer und transkriptomischer Ebene für Echinococcus sowie für eine Vielzahl von parasitären und freilebenden Plattwurm-Modellsystemen.
Daher ebnet die Entwicklung des Gentransferprozesses auf Bandwürmer den Weg für den möglichen Einsatz der neuen Techniken wie virusbasiertes Gen-Mapping oder CRISPR-Cas9-vermitteltes Gen-Editieren. Diese Arbeit präsentiert die lentivirale Transduktion in einem Bandwurmmodell und zeigt vielversprechende Ergebnisse mit potenziellen Auswirkungen auf die Plattwurmbiologie. Noch eingehendere Studien sind erforderlich, um die Methoden zu verbessern und die Anwendbarkeit dieser Techniken für zukünftige Experimente zu entwickeln.
