Transacción transitoria de las formas estrobiladas de Echinococcus granulosus. Describimos una técnica de transducción transitoria rápida en diferentes etapas de desarrollo de Echinococcus granulosus utilizando vectores lentivirales de tercera generación. La equinococosis quística o enfermedad hidatídica es una de las enfermedades parasitarias zoonóticas más importantes causadas por Echinococcus granulosus, una pequeña tenia que se alberga en el intestino de los caninos.
Existe una necesidad urgente de investigación genética aplicada para comprender los mecanismos de patogénesis y el control y la prevención de enfermedades. Sin embargo, la falta de un sistema eficaz de evaluación de genes impide la interpretación directa de la genética funcional de los parásitos cestodos, incluidas las especies de Echinococcus. Los avances en la transferencia de genes en gusanos planos parásitos siguen siendo limitados en comparación con el parásito protozoario.
El uso del sistema de administración viral se ha convertido en una herramienta esencial para la entrega de transgenes y la investigación de genes / proteínas en las últimas dos décadas. Así que evaluamos la transducción transitoria lentiviral del gen reportero GFP a los protoescoleces y gusanos estrobilados de Echinococcus granulosus. La Figura 1 muestra una presentación esquemática del protocolo de estudio para las etapas de Echinococcus granulosus.
Uno, la recolección de quistes hidatídicos. Recolecte quistes hidatídicos hepáticos de ovejas infectadas naturalmente que se sacrifican rutinariamente en un matadero. Esterilizar completamente la superficie del quiste con gasa estéril y alcohol al 70% antes de aspirar los protoescoleces.
Aspire de 20 a 50 ml de líquido hidatídico en tubos cónicos estériles de 50 ml. Después de drenar, borre el quiste con una cuchilla afilada, transfiera la capa germinal a un tubo cónico estéril de 50 ml y agítelo durante un corto período para aumentar la acumulación de protoescoces. Lave los protoescoces con tampón PBS de tres a cinco veces.
Observe los protoescoleces en 0,1% de eosina durante cinco minutos para determinar la viabilidad de los protoscoleces bajo un microscopio de luz. Utilizar protoscoleces con al menos un 95% de viabilidad para el cultivo. Trate el precipitado de protoescoleces con dos ml de pepsina durante 15 a 20 minutos.
Para aislar protoescoleces individuales, resuspenda el sedimento de protoscoleces en PBS y páselo a través de dos capas de gasa estéril en un nuevo tubo cónico estéril de 50 ml. Dos, cultivo bifásico de protoscoleces de Echinococcus granulosus para obtener gusanos adultos. Añadir 10 ml del medio en fase líquida a cada matraz de cultivo cuadrado de 25 centímetros.
Añadir aproximadamente 5.000 protoescoleces al matraz de cultivo y transferirlo a la incubadora de CO2. Después de 24 a 48 horas, transfiera los protoescoleces a un nuevo matraz con la fase sólida y agregue un ml del mismo medio de fase líquida fresca por matraz. Transfiera los matraces a la incubadora, 37 grados centígrados, 5% co2.
Cada cinco a siete días, reemplace el medio con un medio de fase líquida fresca. Tres, cultivo monofásico de protoscoleces de un Echinococcus granulosus. Asegúrese de que el cultivo monofásico se realice de 24 a 48 horas antes de la transducción.
Cultiva aproximadamente 5.000 protoescoleces en un matraz de cultivo cuadrado de 25 centímetros con RPMI y 10%FBS. Transfiera los matraces a la incubadora de CO2 hasta su uso. Cuatro, cultivo celular para la producción y preparación de virus.
Transfiera 500. 000 células HEK a un matraz cuadrado de 25 centímetros que contenga 5 ml de DMEM con 10% de FBS, 100 U/ml de penicilina y 100 microgramos/ml de estreptomicina. Incubar las células HEK2 a 37 grados centígrados en un 5% de CO2 y pasarlas en el medio de cultivo completo cada 48 horas. Finalmente, utilice células HEK de paso bajo para la transducción.
Cinco, producción y preparación del virus con los vectores lentivirales de tercera generación. El primer día, después de tripsinizar las células HEK en placas de cultivo de 6 pocillos, sembrar 70, 000 células por pozo con DMEM fresco libre de antibióticos que contiene 10% FBS. Utilice células de 50 a 60% de confluencia para la transducción por el método de fosfato de calcio.
Día dos, reemplace el medio de cultivo celular dos o tres horas antes del experimento con DMEM fresco libre de antibióticos que contenga 2% de FBS. En un tubo de 1,5 ml, mezcle plásmidos lentivirales de tercera generación, incluidos 7 microgramos/vector de transferencia pCDH513b de microlitro, PLPII de 4 microgramos/microlitro, PLPI de 4 microgramos/microlitro y 2 vectores auxiliares PMD2G de microgramos/microlitro. Agregue el tampón HEPES a la mezcla para alcanzar el volumen de 422 microlitros.
Agregue 16 microlitros de tampón 1% TE a la mezcla. Agregue 62 microlitros de cloruro de calcio de 2.5 ml a los tubos y mezcle bien. Agregue 500 microlitros de tampón HBS 2x a la mezcla, gota a gota en uno o dos minutos con una pipeta Pasteur.
Mezclar suavemente hasta obtener una solución semiopaca e incubar la mezcla durante 20 minutos a temperatura ambiente. Al final, añade la mezcla a cada plato lentamente y distribúyela con movimientos circulares lentos. Incubar las placas a 37 grados Celsius en una incubadora de 5% de CO2 y reemplazar el medio después de cuatro a seis horas con DMEM libre de antibióticos que contenga 10% de FBS.
Día tres, confirme la transducción transitoria exitosa y la viabilidad celular utilizando un microscopio de fluorescencia invertida. Día cuatro, cosechar virus del medio de cultivo recolectando el sobrenadante de cada pozo y almacenarlos a 70 grados centígrados negativos hasta su uso. Seis, transducción transitoria de diferentes estadios de Echinococcus granulosus con el virus.
El primer día, use una placa de cultivo de 12 pocillos para la transferencia de genes. Cultivo de 5.000 a 50.000 células HEK en triplicados con un medio DMEM completo como referencia interna. Cultivo 150 protoescoleces frescos en triplicados en RPMI y 10%FBS.
Cultiva 30 gusanos estrobilados por triplicado en DMEM y FBS 10% inactivado por calor. Prepare una mezcla de 1 millón de virus con cuatro microgramos/ml de reactivo de transfección para transducir las células HEK y las diferentes etapas del gusano. Agregue la mezcla a cada plato lentamente y distribúyala con movimientos circulares lentos.
Incubar las placas durante cuatro a seis horas en una incubadora de CO2, 37 grados Centígrados, 5% CO2. Reemplace el medio para cada muestra con el mismo medio de cultivo completo para minimizar los efectos tóxicos de los reactivos de transfección. Día dos, repita dos pasos anteriores para aumentar la eficiencia de la transducción transitoria para las células HEK, protoescoces y gusanos estrobilados.
Incubar todas las placas durante 24 a 48 horas en una incubadora de CO2 con las mismas condiciones de cultivo en función del tipo de medio celular. Día tres, asegúrese de que la transducción sea exitosa mediante el uso de microscopía de fluorescencia. Resultados representativos.
Aquí describimos una técnica de transducción transitoria rápida y eficiente en Echinococcus granulosus mediante el uso de vectores lentivirales de tercera generación. Cultivamos protoescoleces en medios de cultivo bifásicos para obtener gusanos estrobilados según nuestros estudios previos. Los protoescoleces se desarrollan en los gusanos estrobilados después de un cultivo in vitro de seis semanas.
Se observaron diferentes etapas de Echinococcus granulosus en el medio de cultivo bifásico, incluyendo protoscoleces invaginados, Figura 2A, protoscoleces evaginados, Figura 2B, y gusanos estrobilados con primera y tercera formación proglotides, Figura 2C a E.Protoscoleces y los gusanos estrobilados obtenidos de cultivos monofásicos y bifásicos, respectivamente, fueron transfectados por lentivirus que expresan GFP, Figura 3. Las células HEK expresaron claramente la GFP como control transitorio del proceso de transducción. Los gusanos adultos expresaron GFP más claramente en la capa tegumental.
Sin embargo, los protoescoleces han demostrado un nivel algo más bajo de expresión de GFP después de 48 horas. Algunos residuos de líquido de quiste y/o restos de la capa germinal alrededor de los protoscoleces causaron algún fondo de fluorescencia en las muestras transfectadas. La intensidad de la fluorescencia en las células HEK y los gusanos estrobilados aumentó después de 24 y 48 horas.
Comprender las bases moleculares de los nematodos y la biología de Platyhelminthes es una de las fronteras más importantes en la patogenicidad de los parásitos zoonóticos. La falta de un sistema eficaz de evaluación de genes es un obstáculo importante para la interpretación directa de la genética funcional de los parásitos cestodos, incluidas las especies de Echinococcus. El objetivo principal de este trabajo fue ilustrar el proceso de transducción vectorial lentiviral que será crítico en la futura investigación de la equinococosis.
Los resultados muestran que los gusanos estrobilados son más sensibles a la transducción transitoria del gen que los protoscoleces, que pueden ser el resultado de una extensa estructura tegumental en las formas estrobiladas. Sin embargo, debido a la naturaleza de la transducción lentiviral, la intensidad de la fluorescencia en los protoescoces multicelulares y los gusanos estrobilados suele ser mucho menor que en las células HEK monocapa. Existe una necesidad urgente de investigación genética aplicada a nivel genómico y transcriptómico para Echinococcus, así como una amplia variedad de sistemas modelo de gusanos planos parásitos y de vida libre.
Por lo tanto, el desarrollo del proceso de transferencia de genes a las tenias allana el camino para el uso potencial de las nuevas técnicas, como el mapeo de genes basado en virus o la edición de genes mediada por CRISPR-Cas9. Este trabajo presenta la transducción lentiviral en un modelo de tenia y demuestra resultados prometedores con implicaciones potenciales para la biología del gusano plano. Sin embargo, se requieren estudios más profundos para mejorar los métodos y desarrollar la aplicabilidad de estas técnicas para futuros experimentos.
