Transação transitória das formas estroboscópicas de Echinococcus granulosus. Descrevemos uma técnica de transdução transitória rápida em diferentes estágios de desenvolvimento do Echinococcus granulosus usando vetores lentivirais de terceira geração. A echinocococose cística ou doença hídátida é uma das doenças parasitárias zoonóticas mais importantes causadas pelo Echinococcus granulosus, uma pequena tênia abrigada no intestino dos caninos.
Há uma necessidade urgente de pesquisa genética aplicada para entender mecanismos de patogênese e controle e prevenção de doenças. No entanto, a falta de um sistema de avaliação genética eficaz impede a interpretação direta da genética funcional dos parasitas cestode, incluindo as espécies de Echinococcus. Os avanços na transferência de genes em flatworms parasitas ainda são limitados em comparação com o parasita protozoário.
O uso do sistema de entrega viral surgiu como uma ferramenta essencial para a entrega de transgenes e a investigação de genes/proteínas nas últimas duas décadas. Então avaliamos a transidução transitória lentiviral do gene repórter GFP para os protoscolés e vermes estrofes de Echinococcus granulosus. A Figura 1 demonstra uma apresentação esquemática do protocolo de estudo para as etapas de Echinococcus granulosus.
Um, coletando cistos de hidátida. Recolher cistos de hidátínio hepático de ovelhas naturalmente infectadas rotineiramente abatidos em um matadouro. Esterilize completamente a superfície do cisto usando gaze estéril e 70% de álcool antes de aspirar os protoescoleces.
Aspire de 20 a 50 mL de líquido de hidátida em tubos cônicos estéreis de 50 mL. Depois de drenar, limpe o cisto com uma lâmina afiada, transfira a camada germinal em um tubo cônico estéril de 50 mL e agite-o por um curto período para aumentar a coleta de protoscoleces. Lave os protoscoleces com tampão PBS três a cinco vezes.
Observe os protoscoleces em 0,1%eosina por cinco minutos para determinar a viabilidade dos protoscolés sob um microscópio leve. Use protoscolés com pelo menos 95% de viabilidade para a cultura. Trate os protoscoleces precipitado com dois mL de pepsina por 15 a 20 minutos.
Para isolar protoscoleces individuais, resuspenque o sedimento protoscolés em PBS e passe-o através de duas camadas de gaze estéril em um novo tubo cônico estéril de 50 mL. Dois, cultivo bifásico de protoscolés de Echinococcus granulosus para obter vermes adultos. Adicione 10 mL da fase líquida média a cada frasco de cultura quadrado de 25 centímetros.
Adicione aproximadamente 5.000 protoscoleas ao frasco de cultura e transfira-o para a incubadora de CO2. Após 24 a 48 horas, transfira os protoscolés para um novo frasco com a fase sólida e adicione um mL do mesmo meio de fase líquida fresca por frasco. Transfira os frascos para a incubadora, 37 graus Celsius, 5% de CO2.
A cada cinco ou sete dias, substitua o meio por meio de fase líquida fresca. Três, cultivo monofásico de protoscolés de um granuloso de Echinococcus. Certifique-se de que o cultivo monofásico seja feito de 24 a 48 horas antes da transdução.
Cultura aproximadamente 5.000 protoscoleces em um frasco de cultura de 25 centímetros quadrados com RPMI e 10% FBS. Transfira os frascos para a incubadora de CO2 até usar. Quatro, cultura celular para produção e preparação de vírus.
Transfira 500.000 células HEK para um frasco quadrado de 25 centímetros contendo 5 mL de DMEM com 10%FBS, penicilina de 100 U/mL e 100 microgramas/mL estreptomicina. Incubar as células HEK2 a 37 graus Celsius em 5% de CO2 e passá-las no meio de cultura completa a cada 48 horas. Por fim, use células HEK de baixa passagem para transdução.
Cinco, produção e preparação do vírus com os vetores lentivirais de terceira geração. Primeiro dia, depois de experimentar as células HEK em placas de cultura de 6 poços, sementes 70.000 células por poço com DMEM fresco sem antibióticos contendo 10% FBS. Use células de 50 a 60% de confluência para transdução pelo método fosfato de cálcio.
Dia 2, substitua o meio de cultura celular de duas a três horas antes do experimento com DMEM fresco sem antibióticos contendo 2% de FBS. Em um tubo de transferência de 1,5 mL, misture plasmídeos lentivirais de terceira geração, incluindo 7 microgramas/microliter pCDH513b, 4 microgramas/microliter PLPII, 4 microgramas/microliter PLPI e 2 microgramas/microliter PMD2G vetor vetor. Adicione o tampão HEPES à mistura para atingir o volume de 422 microliters.
Adicione 16 microliters de tampão de 1%TE à mistura. Adicione 62 microliters de cloreto de cálcio de 2,5 mL aos tubos e misture bem. Adicione 500 microliters de tampão HBS 2x à mistura, deixe cair em uma ou duas minutos usando uma pipeta Pasteur.
Misture suavemente até obter uma solução semi-opaca e incubar a mistura por 20 minutos à temperatura ambiente. Na extremidade, adicione a mistura a cada prato lentamente e distribua-a com movimentos circulares lentos. Incubar as placas a 37 graus Celsius em uma incubadora de CO2 de 5% e substituir o médio após quatro a seis horas por DMEM livre de antibióticos contendo 10% de FBS.
Terceiro dia, confirme a transdução transitória bem sucedida e a viabilidade celular usando um microscópio de fluorescência invertida. No quarto dia, colhe vírus do meio cultural coletando o supernanato de cada poço e armazenando-os a 70 graus Celsius negativos até o uso. Seis, transdução transitória de diferentes estágios de Echinococcus granulosus com o vírus.
Primeiro dia, use uma placa de cultura de 12 poços para transferência de genes. Cultura 5.000 a 50.000 células HEK em triplicados com um meio DMEM completo como referência interna. Cultura 150 protoscolés frescos em triplicados em RPMI e 10% FBS.
Cultura 30 vermes estrobofeinados em triplicado em DMEM e FBS 10% inativados pelo calor. Prepare uma mistura de 1 milhão de vírus com quatro microgramas/mL reagente de transfecção para transduturar as células HEK e diferentes estágios do verme. Adicione a mistura a cada prato lentamente e distribua-a com movimentos circulares lentos.
Incubar as placas por quatro a seis horas em uma incubadora de CO2, 37 graus Celsius, 5%CO2. Substitua o meio por cada amostra com o mesmo meio de cultura completo para minimizar os efeitos tóxicos dos reagentes de transfecção. Segundo dia, repita duas etapas anteriores para aumentar a eficiência da transdução transitória para as células HEK, protoscolés e vermes estroboscópios.
Incubar todas as placas por 24 a 48 horas em uma incubadora de CO2 com as mesmas condições de cultura baseadas no tipo de mídia celular. Terceiro dia, certifique-se de que a transdução seja bem sucedida usando microscopia de fluorescência. Resultados representativos.
Aqui descrevemos uma técnica de transdução transitória rápida e eficiente em Echinococcus granulosus usando vetores lentivirais de terceira geração. Nós cultuamos protoscolés em meios de cultura bifásica para obter vermes estrobofados de acordo com nossos estudos anteriores. Protoscoleces são desenvolvidos nos vermes estrogonofados após uma cultura in vitro de seis semanas.
Diferentes estágios de Echinococcus granulosus foram observados no meio da cultura bifásica, incluindo protoscolés invaginados, Figura 2A, protoscolés evagidos, Figura 2B, e vermes estrogonofados com primeira e terceira formação proglote, Figura 2C através de E.Protoscoleces e os vermes estrôncios obtidos a partir de cultivos monofásicos e bifásicos, respectivamente, foram transfeinados por lentivírus expressos por GFP, Figura 3. As células HEK expressaram claramente o GFP como controle de processo de transdução transitória. Os vermes adultos expressaram GFP mais distintamente na camada tegumental.
No entanto, as protoscolés demonstraram um nível um pouco mais baixo de expressão GFP após 48 horas. Alguns resíduos de fluidos de cisto e ou detritos de camada germinal ao redor dos protoscoleces causaram algum fundo de fluorescência nas amostras transfeinadas. A intensidade da fluorescência em células HEK e vermes estroboscópicos aumentou após 24 e 48 horas.
Compreender a base molecular de nematoides e platyhelminthes biologia é uma das fronteiras mais importantes na patogenicidade dos parasitas zoonóticos. A falta de um sistema de avaliação genética eficaz é um grande obstáculo para a interpretação direta da genética funcional dos parasitas cestode, incluindo as espécies de Echinococcus. O principal objetivo deste trabalho foi ilustrar o processo de transdução de vetores lentiviral que será fundamental na futura pesquisa de Echinococcosis.
Os resultados mostram que os vermes estrobofeinados são mais responsivos à transdução transitória do gene do que as protoscolés, o que pode ser o resultado de uma extensa estrutura tegumental nas formas estrobilizadas. No entanto, devido à natureza da transdução lentiviral, a intensidade da fluorescência nos protoscolés multicelulares e vermes estroboscopados é tipicamente muito menor do que as células HEK monocamadas. Há uma necessidade urgente de pesquisa genética aplicada nos níveis genômico e transcriptômico para Echinococcus, bem como uma grande variedade de sistemas modelos de flatworm parasiticos e livres.
Portanto, o desenvolvimento do processo de transferência de genes para as tênias abre caminho para o uso potencial das novas técnicas, como mapeamento genético baseado em vírus ou edição de genes mediados pelo CRISPR-Cas9. Este trabalho apresenta transdução lentiviral em um modelo de tênia e demonstram resultados promissores com potencial implicação para a biologia da minhoca. Ainda mais estudos aprofundados são necessários para melhorar os métodos e desenvolver a aplicabilidade dessas técnicas para experimentos futuros.
