Transaction transitoire des formes strobilées d’Echinococcus granulosus. Nous décrivons une technique de transduction transitoire rapide à différents stades de développement d’Echinococcus granulosus en utilisant des vecteurs lentiviraux de troisième génération. L’échinococcose kystique ou maladie hydatide est l’une des maladies parasitaires zoonotiques les plus importantes causées par Echinococcus granulosus, un petit ténia hébergé dans l’intestin des chiens.
Il est urgent de mener des recherches en génétique appliquée pour comprendre les mécanismes de pathogenèse et de contrôle et de prévention des maladies. Cependant, l’absence d’un système efficace d’évaluation des gènes entrave l’interprétation directe de la génétique fonctionnelle des parasites cestodes, y compris les espèces d’Echinococcus. Les progrès dans le transfert de gènes chez les vers plats parasites sont encore limités par rapport au parasite protozoaire.
L’utilisation du système d’administration virale est devenue un outil essentiel pour l’administration de transgènes et l’étude des gènes et des protéines au cours des deux dernières décennies. Nous avons donc évalué la transduction transitoire lentivirale du gène rapporteur GFP aux protoscolèces et aux vers strobilés d’Echinococcus granulosus. La figure 1 illustre une présentation schématique du protocole d’étude pour les stades d’Echinococcus granulosus.
Premièrement, la collecte de kystes hydatiques. Recueillir les kystes hydatiques hépatiques de moutons naturellement infectés régulièrement abattus dans un abattoir. Stérilisez complètement la surface du kyste à l’aide de gaze stérile et de 70% d’alcool avant d’aspirer les protoscolacées.
Aspirer 20 à 50 mL de liquide hydatide dans des tubes coniques stériles de 50 mL. Après le drainage, épongez le kyste avec une lame tranchante, transférez la couche germinale dans un tube conique stérile de 50 mL et secouez-le pendant une courte période pour augmenter la collecte de protoscolèces. Lavez les protoscolèces avec un tampon PBS trois à cinq fois.
Observez les protoscolacées dans 0,1% d’éosine pendant cinq minutes pour déterminer la viabilité des protoscolèces au microscope optique. Utilisez des protoscolèces avec une viabilité d’au moins 95% pour la culture. Traiter le précipité des protoscolèces avec deux mL de pepsine pendant 15 à 20 minutes.
Pour isoler les protoscolacées individuelles, ressuspendez les sédiments de protoscoleces dans le PBS et passez-les à travers deux couches de gaze stérile dans un nouveau tube conique stérile de 50 mL. Deux, la culture biphasique de protoscolèces d’Echinococcus granulosus pour obtenir des vers adultes. Ajouter 10 mL du milieu de phase liquide à chaque fiole de culture de 25 centimètres carrés.
Ajouter environ 5 000 protoscolèces à la fiole de culture et la transférer dans l’incubateur à CO2. Après 24 à 48 heures, transférer les protoscolèces dans une nouvelle fiole avec la phase solide et ajouter un mL du même milieu de phase liquide frais par fiole. Transférer les flacons dans l’incubateur, 37 degrés Celsius, 5% CO2.
Tous les cinq à sept jours, remplacez le milieu par un milieu liquide frais. Trois, culture monophasique de protoscolèces d’un Echinococcus granulosus. Assurez-vous que la culture monophasique est faite 24 à 48 heures avant la transduction.
Culture d’environ 5 000 protoscolèces dans une fiole de culture de 25 centimètres carrés avec RPMI et 10% FBS. Transférer les flacons dans l’incubateur à CO2 jusqu’à utilisation. Quatrièmement, la culture cellulaire pour la production et la préparation de virus.
Transférer 500 000 cellules HEK dans une fiole de 25 centimètres carrés contenant 5 mL de DMEM avec 10% FBS, 100 U / mL de pénicilline et 100 microgrammes / mL de streptomycine. Incuber les cellules HEK2 à 37 degrés Celsius dans 5% de CO2 et les passer dans le milieu de culture complet toutes les 48 heures. Enfin, utilisez des cellules HEK à faible passage pour la transduction.
Cinquièmement, la production et la préparation du virus avec les vecteurs lentiviraux de troisième génération. Le premier jour, après avoir essayé les cellules HEK dans une plaque de culture à 6 puits, ensemencez 70 000 cellules par puits avec du DMEM frais sans antibiotique contenant 10% de FBS. Utilisez des cellules à une confluence de 50 à 60% pour la transduction par la méthode du phosphate de calcium.
Deuxième jour, remplacez le milieu de culture cellulaire deux à trois heures avant l’expérience par du DMEM frais sans antibiotique contenant 2% de FBS. Dans un tube de 1,5 mL, mélanger des plasmides lentiviraux de troisième génération, y compris 7 microgrammes/microlitres de vecteur de transfert pCDH513b, 4 microgrammes/microlitres PLPII, 4 microgrammes/microlitres PLPI et 2 microgrammes/microlitres PMD2G vecteurs auxiliaires. Ajouter le tampon HEPES au mélange pour atteindre le volume de 422 microlitres.
Ajouter 16 microlitres de tampon 1% TE au mélange. Ajouter 62 microlitres de 2,5 mL de chlorure de calcium aux tubes et bien mélanger. Ajouter 500 microlitres de 2x tampon HBS au mélange, goutte à goutte en une à deux minutes à l’aide d’une pipette Pasteur.
Mélanger doucement jusqu’à l’obtention d’une solution semi-opaque et incuber le mélange pendant 20 minutes à température ambiante. À la fin, ajoutez lentement le mélange à chaque plaque et répartissez-le avec des mouvements circulaires lents. Incuber les plaques à 37 degrés Celsius dans un incubateur à 5% de CO2 et remplacer le milieu après quatre à six heures par du DMEM sans antibiotique contenant 10% de FBS.
Le troisième jour, confirmer la transduction transitoire réussie et la viabilité cellulaire à l’aide d’un microscope à fluorescence inversée. Quatrième jour, récoltez les virus du milieu de culture en collectant le surnageant de chaque puits et stockez-les à 70 degrés Celsius négatifs jusqu’à leur utilisation. Six, transduction transitoire de différents stades d’Echinococcus granulosus avec le virus.
Le premier jour, utilisez une plaque de culture à 12 puits pour le transfert de gènes. Culture 5 000 à 50 000 cellules HEK en triples avec un milieu DMEM complet comme référence interne. Culture 150 protoscolèces fraîches en triples dans RPMI et 10%FBS.
Culture 30 vers strobilés en triple d’un DMEM et d’un FBS inactivé à 10 % par la chaleur. Préparez un mélange de 1 million de virus avec quatre microgrammes/mL de réactif de transfection pour transduire les cellules HEK et les différents stades du ver. Ajouter le mélange à chaque plaque lentement et le répartir avec des mouvements circulaires lents.
Incuber les plaques pendant quatre à six heures dans un incubateur à CO2, 37 degrés Celsius, 5% CO2. Remplacer le milieu de chaque échantillon par le même milieu de culture complet pour minimiser les effets toxiques des réactifs de transfection. Deuxième jour, répétez deux étapes précédentes pour augmenter l’efficacité de la transduction transitoire pour les cellules HEK, les protoscolèces et les vers strobilés.
Incuber toutes les plaques pendant 24 à 48 heures dans un incubateur à CO2 avec les mêmes conditions de culture en fonction du type de milieu cellulaire. Troisième jour, assurez-vous que la transduction est réussie en utilisant la microscopie à fluorescence. Résultats représentatifs.
Nous décrivons ici une technique de transduction transitoire rapide et efficace chez Echinococcus granulosus en utilisant des vecteurs lentiviraux de troisième génération. Nous avons cultivé des protoscolèces dans des milieux de culture biphasiques pour obtenir des vers strobilés selon nos études précédentes. Les protoscoléces sont développés dans les vers strobilés après une culture in vitro de six semaines.
Différents stades d’Echinococcus granulosus ont été observés dans le milieu de culture biphasique, y compris les protoscolèces invaginées, figure 2A, les protoscolèces evaginées, figure 2B, et les vers strobilés avec première et troisième formation de proglottes, figure 2C à E.Protoscoleces et les vers strobilés obtenus à partir de cultures monophasiques et biphasiques, respectivement, ont été transfectés par des lentivirus exprimant la GFP, figure 3. Les cellules HEK ont clairement exprimé la GFP en tant que contrôle transitoire du processus de transduction. Les vers adultes exprimaient la GFP le plus distinctement dans la couche tégumentale.
Cependant, les protoscoléces ont démontré un niveau un peu plus faible d’expression de GFP après 48 heures. Certains résidus de liquide kystique et/ou débris de couche germinale autour des protoscolèces ont provoqué un fond de fluorescence dans les échantillons transfectés. L’intensité de la fluorescence dans les cellules HEK et les vers strobilés a augmenté après 24 et 48 heures.
Comprendre la base moléculaire des nématodes et la biologie de Platyhelminthes est l’une des frontières les plus importantes de la pathogénicité des parasites zoonotiques. L’absence d’un système efficace d’évaluation des gènes est un obstacle majeur à l’interprétation directe de la génétique fonctionnelle des parasites cestodes, y compris les espèces d’Echinococcus. L’objectif principal de ce travail était d’illustrer le processus de transduction du vecteur lentiviral qui sera critique dans la recherche future sur l’échinococcose.
Les résultats montrent que les vers strobilés sont plus sensibles à la transduction transitoire du gène que les protoscolèces, ce qui peut être le résultat d’une structure tégumentale étendue dans les formes strobilées. Cependant, en raison de la nature de la transduction lentivirale, l’intensité de fluorescence dans les protoscolacées multicellulaires et les vers strobilés est généralement beaucoup plus faible que celle des cellules HEK monocouches. Il existe un besoin urgent de recherche génétique appliquée aux niveaux génomique et transcriptomique pour Echinococcus ainsi que d’une grande variété de systèmes modèles de vers plats parasites et libres.
Par conséquent, le développement du processus de transfert de gènes aux ténias ouvre la voie à l’utilisation potentielle de nouvelles techniques telles que la cartographie génétique basée sur le virus ou l’édition de gènes médiée par CRISPR-Cas9. Ces travaux présentent la transduction lentivirale dans un modèle de ténia et démontrent des résultats prometteurs avec des implications potentielles pour la biologie des vers plats. Des études plus approfondies sont encore nécessaires pour améliorer les méthodes et développer l’applicabilité de ces techniques pour de futures expériences.
