Транзиторная транзакция стробилированных форм Echinococcus granulosus. Описана методика быстрой транзиторной трансдукции на разных стадиях развития Echinococcus granulosus с использованием лентивирусных векторов третьего поколения. Кистозный эхинококкоз или эхинококковое заболевание является одним из наиболее важных зоонозных паразитарных заболеваний, вызванных Echinococcus granulosus, небольшим ленточным червем, укрывающимся в кишечнике собак.
Существует острая необходимость в прикладных генетических исследованиях для понимания механизмов патогенеза и контроля и профилактики заболеваний. Однако отсутствие эффективной системы оценки генов препятствует прямой интерпретации функциональной генетики цестодных паразитов, в том числе видов эхинококка. Достижения в переносе генов у паразитических плоских червей все еще ограничены по сравнению с простейшими паразитами.
Использование системы доставки вируса стало важным инструментом для доставки трансгенов и исследования генов / белков за последние два десятилетия. Поэтому мы оценили лентивирусную транзиторную трансдукцию гена-репортера GFP к протосколецам и стробилированным червям Echinococcus granulosus. На рисунке 1 показано схематическое представление протокола исследования для стадий Echinococcus granulosus.
Одна, собирающая эхинококковые кисты. Соберите кисты эхинококка печени у естественно инфицированных овец, которых обычно забивают на скотобойне. Полностью стерилизуют поверхность кисты, используя стерильную марлю и 70% спирт перед аспирацией протосколек.
Аспират от 20 до 50 мл эхинококковой жидкости выходит в стерильные конические трубки объемом 50 мл. После дренирования смыть кисту острым лезвием, перенести зародышевый слой в стерильную коническую трубку объемом 50 мл и встряхнуть ее на короткий период для увеличения сбора протосколеций. Промыть протосколеки с буфером PBS три-пять раз.
Наблюдайте протосколеки в 0,1% эозина в течение пяти минут, чтобы определить жизнеспособность протосколек под световым микроскопом. Используйте протосколеки с не менее чем 95% жизнеспособностью для культуры. Обработайте осадок протосколек двумя мл пепсина в течение 15-20 минут.
Чтобы выделить отдельные протосколеки, повторно суспендируют осадок протосколек в PBS и пропускают его через два слоя стерильной марли в новую стерильную коническую трубку объемом 50 мл. Во-вторых, двухфазное культивирование протосколек Echinococcus granulosus для получения взрослых червей. Добавьте 10 мл жидкофазной среды в каждую 25-сантиметровую квадратную колбу для культивирования.
Добавьте приблизительно 5000 протосколек в колбу для культивирования и перенесите ее в ИНКУБАТОР CO2. Через 24-48 часов переложите протосколеки в новую колбу с твердой фазой и добавьте один мл той же свежей жидкофазной среды на колбу. Переложите колбы в инкубатор, 37 градусов Цельсия, 5% CO2.
Каждые пять-семь дней заменяйте среду свежей жидкофазной средой. В-третьих, монофазное культивирование протосколек Echinococcus granulosus. Убедитесь, что монофазное культивирование проводится за 24-48 часов до трансдукции.
Культивируйте приблизительно 5000 протосколек в 25-сантиметровую квадратную культуральную колбу с RPMI и 10% FBS. Переложите колбы в CO2-инкубатор до использования. В-четвертых, клеточная культура для производства и подготовки вируса.
Перенесите 500 000 HEK-клеток в 25-сантиметровую квадратную колбу, содержащую 5 мл DMEM с 10% FBS, 100 ЕД/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина. Инкубируйте клетки HEK2 при 37 градусах Цельсия в 5% CO2 и пропускайте их в полную культуральную среду каждые 48 часов. Наконец, используйте низкопроходные HEK-клетки для трансдукции.
Пятое, производство и подготовка вируса с лентивирусными векторами третьего поколения. День первый, после пробизации клеток HEK в 6-луночных культуральных пластинах, семена 70 000 клеток на лунку со свежим DMEM без антибиотиков, содержащим 10% FBS. Используйте клетки со слиянием от 50 до 60% для трансдукции методом фосфата кальция.
На второй день замените среду для культивирования клеток за два-три часа до эксперимента свежим DMEM без антибиотиков, содержащим 2% FBS. В пробирке объемом 1,5 мл смешайте лентивирусные плазмиды третьего поколения, включая вектор переноса 7 микрограммов/ микролитр pCDH513b, 4 микрограмма / микролитр PLPII, 4 микрограмма / микролитр PLPI и 2 микрограмма / микролитр PMD2G вспомогательных векторов. Добавьте буфер HEPES в смесь, чтобы достичь объема 422 микролитров.
Добавьте в смесь 16 микролитров буфера 1%TE. Добавьте в пробирки 62 микролитра хлорида кальция 2,5 мл и хорошо перемешайте. Добавьте 500 микролитров 2x HBS буфера в смесь, капля за каплей в течение одной-двух минут с помощью пипетки Пастера.
Осторожно перемешайте до получения полунепрозрачного раствора и инкубируйте смесь в течение 20 минут при комнатной температуре. В конце медленно добавьте смесь в каждую тарелку и распределите ее медленными круговыми движениями. Инкубируйте пластины при 37 градусах Цельсия в инкубаторе с 5% CO2 и замените среду через четыре-шесть часов dmEM без антибиотиков, содержащим 10% FBS.
День третий, подтвердите успешную транзиторную трансдукцию и жизнеспособность клеток с помощью инвертированного флуоресцентного микроскопа. День четвертый, соберите вирусы из питательной среды, собрав супернатант каждой скважины и храните их при отрицательных 70 градусах Цельсия до использования. Шесть, преходящая трансдукция различных стадий Echinococcus granulosus с вирусом.
В первый день используйте 12-луночную культуральную пластину для переноса генов. Культивирование от 5 000 до 50 000 КЛЕТОК HEK в трех экземплярах с полной средой DMEM в качестве внутреннего эталона. Культивирование 150 свежих протосколек в трех экземплярах в RPMI и 10% FBS.
Культивируйте 30 стробилизированных червей в трипликате в DMEM и 10% термоинактивированный FBS. Приготовьте смесь из 1 миллиона вирусов с рефекционным реагентом для трансфекции четырех микрограммов / мл для трансдукции клеток HEK и различных стадий червя. Медленно добавляйте смесь в каждую тарелку и распределяйте ее медленными круговыми движениями.
Инкубируйте пластины в течение четырех-шести часов в co2-инкубаторе, 37 градусов цельсия, 5% CO2. Замените среду для каждого образца одной и той же полной питательной средой, чтобы свести к минимуму токсическое воздействие трансфекционных реагентов. На второй день повторите два предыдущих шага, чтобы повысить эффективность транзиторной трансдукции для клеток HEK, протосколек и стробилированных червей.
Инкубируйте все пластины в течение 24-48 часов в CO2-инкубаторе с теми же условиями культивирования в зависимости от типа клеточной среды. День третий, убедитесь, что трансдукция успешна, используя флуоресцентную микроскопию. Репрезентативные результаты.
Здесь мы описываем быстрый и эффективный метод транзиторной трансдукции у Echinococcus granulosus с использованием лентивирусных векторов третьего поколения. Мы культивировали протосколек в двухфазных культуральных средах для получения стробилированных червей в соответствии с нашими предыдущими исследованиями. Протосколеки развиваются в стробилированных червей после шестинедельной культуры in vitro.
Различные стадии Echinococcus granulosus наблюдались в двухфазной культуральной среде, включая инвагинированные протосколеки, Рисунок 2А, эвагинированные протосколеки, Рисунок 2В, и стробилированные черви с образованием первого и третьего проглоттид, Рисунок 2С через E.Протосколеки и стробилированные черви, полученные из монофазных и двухфазных культивирований, соответственно, трансфектировались GFP-экспрессирующими лентивирусами, Рисунок 3. Клетки HEK четко экспрессировали GFP как управление процессом транзиторной трансдукции. Взрослые черви наиболее отчетливо экспрессировали GFP в тегументальном слое.
Однако протосколеки продемонстрировали несколько более низкий уровень экспрессии GFP через 48 часов. Некоторые остатки жидкости кисты и/или обломки зародышевого слоя вокруг протосколек вызывали некоторый фон флуоресценции в трансфектированных образцах. Интенсивность флуоресценции в клетках HEK и стробилированных червях увеличивалась через 24 и 48 часов.
Понимание молекулярной основы биологии нематод и Platyhelminthes является одним из наиболее важных рубежей в патогенности зоонозных паразитов. Отсутствие эффективной системы оценки генов является основным препятствием для прямой интерпретации функциональной генетики цестодных паразитов, включая виды Echinococcus. Основной целью этой работы было проиллюстрировать процесс лентивирусной векторной трансдукции, который будет иметь решающее значение в будущих исследованиях эхинококкоза.
Результаты показывают, что стробилированные черви более чувствительны к транзиторной трансдукции гена, чем протосколеки, что может быть результатом обширной тегументальной структуры в стробилированных формах. Однако из-за природы лентивирусной трансдукции интенсивность флуоресценции у многоклеточных протосколек и стробилированных червей обычно намного ниже, чем у монослойных КЛЕТОК HEK. Существует острая необходимость в прикладных генетических исследованиях на геномном и транскриптомном уровнях для эхинококка, а также в широком спектре паразитических и свободноживущих модельных систем плоских червей.
Таким образом, развитие процесса переноса генов ленточным червям прокладывает путь для потенциального использования новых методов, таких как картирование генов на основе вирусов или редактирование генов, опосредованное CRISPR-Cas9. Эта работа представляет лентивирусную трансдукцию в модели ленточного червя и демонстрирует многообещающие результаты с потенциальными последствиями для биологии плоских червей. Еще больше углубленных исследований требуется для улучшения методов и разработки применимости этих методов для будущих экспериментов.
