עסקה חולפת של הצורות הסטרוביליות של Echinococcus granulosus. אנו מתארים טכניקת התמרה חולפת מהירה בשלבים התפתחותיים שונים של Echinococcus granulosus באמצעות וקטורים לנטי-ויראליים מהדור השלישי. אכינוקוקוזיס ציסטי או מחלה הידאטית היא אחת המחלות הטפיליות הזואונוטיות החשובות ביותר הנגרמות על ידי Echinococcus granulosus, תולעת סרט קטנה הניצבת במעי של כלבים.
יש צורך דחוף במחקר גנטי יישומי כדי להבין מנגנונים של פתוגנזה ובקרת מחלות ומניעתן. עם זאת, היעדר מערכת יעילה להערכת גנים מעכב פרשנות ישירה של גנטיקה תפקודית של טפילי צסטודה, כולל מיני אכינוקוק. ההתקדמות בהעברת גנים בתולעים שטוחות טפיליות עדיין מוגבלת בהשוואה לטפיל פרוטוזואני.
השימוש במערכת ההובלה הנגיפית התגלה ככלי חיוני להעברת טרנסגנים ולחקירת גנים/חלבונים בשני העשורים האחרונים. לכן הערכנו את ההעתקה הארעית ה-lentiviral של הגן הכתב GFP לפרוטוסקולקסים ולתולעים הסטרוביליות של אכינוקוקוס גרנולוסוס. איור 1 מדגים הצגה סכמטית של פרוטוקול המחקר עבור שלבי Echinococcus granulosus.
האחת, איסוף ציסטות מהידאטיות. אספו ציסטות כבדות מכבשים נגועות באופן טבעי שנשחטו באופן שגרתי באבטואר. לעקר לחלוטין את משטח הציסטה באמצעות גזה סטרילית ו-70% אלכוהול לפני שאיפת הפרוטוסקולקים.
לשאוף 20 עד 50 מ"ל של נוזל hydatid החוצה לתוך צינורות חרוטיים סטריליים 50 מ"ל. לאחר הניקוז, מכתימים את הציסטה עם להב חד, מעבירים את שכבת הנביטה לצינור חרוטי סטרילי של 50 מ"ל, ומנערים אותה לתקופה קצרה כדי להגדיל את אוסף הפרוטוסקולקים. שטפו את הפרוטוסקולקים עם חיץ PBS שלוש עד חמש פעמים.
שימו לב לפרוטוסקולקים ב-0.1% eosin במשך חמש דקות כדי לקבוע את הכדאיות של הפרוטוסקולקסים תחת מיקרוסקופ אור. השתמש בפרוטוסקולקים עם לפחות 95% כדאיות לתרבות. יש לטפל בפרוטוסקולקים עם שני מ"ל של פפסין למשך 15 עד 20 דקות.
כדי לבודד פרוטוסקולקים בודדים, יש לבודד את משקעי הפרוטוסקולקס ב-PBS ולהעבירם דרך שתי שכבות של גזה סטרילית לתוך צינור חרוטי סטרילי חדש של 50 מ"ל. שתיים, טיפוח דו-פאזי של פרוטוסקולקים של אכינוקוק גרנולוסוס כדי להשיג תולעים בוגרות. הוסף 10 מ"ל של מדיום הפאזה הנוזלית לכל בקבוקון תרבית בריבוע של 25 ס"מ.
הוסף כ 5, 000 protoscoleces לבקבוקון התרבות ולהעביר אותו לחממת CO2. לאחר 24 עד 48 שעות, מעבירים את הפרוטוסקולקים לבקבוקון חדש עם הפאזה המוצקה ומוסיפים מ"ל אחד מאותו מדיום פאזה נוזלית טרייה לכל בקבוקון. מעבירים את הצלוחיות לחממה, 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2.
כל חמישה עד שבעה ימים, החליפו את המדיום במדיום פאזה נוזלית טרייה. שלוש, טיפוח מונופאזי של פרוטוסקולקים של גרנולוסוס אכינוקוק. ודא שהטיפוח החד-פאזי נעשה 24 עד 48 שעות לפני ההעתקה.
תרבית כ-5, 000 פרוטוסקולקים בבקבוקון תרבות בריבוע של 25 ס"מ עם RPMI ו-10% FBS. מעבירים את הצלוחיות לחממת CO2 עד לשימוש. ארבע, תרבית תאים לייצור והכנה של וירוסים.
העבר 500, 000 תאי HEK לבקבוק בריבוע של 25 ס"מ המכיל 5 מ"ל של DMEM עם 10% FBS, 100 פניצילין U/mL ו-100 מיקרוגרם/מ"ל סטרפטומיצין. דגירה של תאי HEK2 ב-37 מעלות צלזיוס ב-5%CO2 והעברתם במדיום התרבית השלם כל 48 שעות. לבסוף השתמש בתאי HEK במעבר נמוך להתמרה.
חמישה, ייצור והכנה של הנגיף עם הדור השלישי של וקטורים lentiviral. ביום הראשון, לאחר שניסיתי את תאי ה-HEK בצלחות תרבית של 6 בארות, זרע 70, 000 תאים לכל באר עם DMEM טרי ללא אנטיביוטיקה המכיל 10%FBS. השתמש בתאים ב-50% עד 60% מפגש לצורך התמרה בשיטת סידן פוספט.
ביום השני, החליפו את מדיום תרביות התאים שעתיים-שלוש לפני הניסוי ב-DMEM טרי ללא אנטיביוטיקה המכיל 2%FBS. בצינור של 1.5 מ"ל, יש לערבב פלסמידים לנטי-ויראליים מהדור השלישי, כולל וקטור העברת pCDH513b של מיקרוגרם/מיקרוליטר pCDH513b, 4 מיקרוגרם/מיקרוליטר PLPI, 4 מיקרוגרם/מיקרוליטר PLPI, ו-2 וקטורים עוזרי PMD2G מיקרוגרם/מיקרוליטר. הוסיפו את מאגר ה-HEPES לתערובת כדי להגיע לנפח של 422 מיקרוליטרים.
הוסיפו לתערובת 16 מיקרוליטרים של מאגר TE של 1%. מוסיפים 62 מיקרוליטרים של 2.5 מ"ל סידן כלורי לצינורות ומערבבים היטב. הוסיפו לתערובת 500 מיקרוליטרים של מאגר HBS 2x, טיפה אחר טיפה תוך דקה עד שתי דקות באמצעות פיפטת פסטר.
מערבבים בעדינות עד לקבלת תמיסה אטומה למחצה ומדגרים את התערובת למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר. בסוף, מוסיפים את התערובת לכל צלחת לאט ומפיצים אותה בתנועות מעגליות איטיות. דגירו את הצלחות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באינקובטור 5% CO2 והחליפו את המדיום לאחר ארבע עד שש שעות ב-DMEM ללא אנטיביוטיקה המכיל 10%FBS.
ביום השלישי, אשרו התמרה ארעית מוצלחת ואת כדאיות התא באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך. ביום הרביעי, לקצור וירוסים ממדיום התרבית על ידי איסוף הסופרנאטנט של כל באר ולאחסן אותם בטמפרטורה שלילית של 70 מעלות צלזיוס עד לשימוש. שש, התמרה חולפת של שלבים שונים של Echinococcus granulosus עם הנגיף.
ביום הראשון, השתמשו בצלחת תרבית בת 12 בארות להעברת גנים. תרבית 5, 000 עד 50, 000 תאי HEK במשולש עם מדיום DMEM שלם כהפניה פנימית. תרבות 150 פרוטוסקולקים טריים בטריפליקטים ב-RPMI ו-10% FBS.
תרבית 30 תולעים משוכלות ב-DMEM ו-10% FBS מומת חום. הכינו תערובת של מיליון וירוסים עם ארבעה מיקרוגרם/מ"ל ריאגנט טרנספקציה כדי לתמר את תאי ה-HEK ואת השלבים השונים של התולעת. מוסיפים את התערובת לכל צלחת באיטיות ומפיצים אותה בתנועות מעגליות איטיות.
דגירה של הצלחות במשך ארבע עד שש שעות בחממת CO2, 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2. החלף את המדיום עבור כל דגימה באותו מדיום תרבית שלם כדי למזער את ההשפעות הרעילות של ריאגנטים טרנספקציה. ביום השני, חזור על שני צעדים קודמים להגברת היעילות של התמרה חולפת עבור תאי HEK, פרוטוסקולקסים ותולעים סטרוביליות.
דגירה של כל הצלחות למשך 24 עד 48 שעות בחממת CO2 עם אותם תנאי תרבית המבוססים על סוג המדיה התאית. ביום השלישי, וודאו שההתמרה מוצלחת באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית. תוצאות מייצגות.
כאן אנו מתארים טכניקת התמרה חולפת מהירה ויעילה באכינוקוק גרנולוסוס על ידי שימוש בווקטורים לנטי-ויראליים מהדור השלישי. תרבנו פרוטוסקולקים במדיה של תרבויות דו-פאזיות כדי להשיג תולעים סטרוביליות על פי המחקרים הקודמים שלנו. פרוטוסקולקסים מפותחים לתולעים סטרוביליות לאחר תרבות מבחנה בת שישה שבועות.
שלבים שונים של Echinococcus granulosus נצפו בתווך התרבית הדו-פאזית, כולל פרוטוסקולקסים בלתי משתנים, איור 2A, פרוטוסקולקסים שהתאדו, איור 2B, ותולעים סטרוביטיביות עם היווצרות פרוגלוטידים ראשונה ושלישית, איור 2C עד E.Protoscoleces והתולעים הסטרובילות שהתקבלו ממטפחים מונופאזיים וביפאזיים, בהתאמה, הועתקו על ידי לנטי-וירוסים המבטאים GFP, איור 3. תאי HEK ביטאו בבירור את ה-GFP כבקרת תהליך התמרה חולפת. התולעים הבוגרות ביטאו את ה-GFP בצורה המובהקת ביותר בשכבה הטגומנטלית.
עם זאת, פרוטוסקולקים הדגימו רמה מעט נמוכה יותר של ביטוי GFP לאחר 48 שעות. חלק משאריות נוזל הציסטה ופסולת שכבת הנביטה סביב הפרוטוסקולקים גרמו לרקע פלואורסצנטי מסוים בדגימות המועברות. עוצמת הפלואורסצנציה בתאי HEK ובתולעים סטרוביליות עלתה לאחר 24 ו-48 שעות.
הבנת הבסיס המולקולרי של נמטודות וביולוגיה של פלטיהלמינתס היא אחד הגבולות החשובים ביותר בפתוגניות של טפילים זואונוטיים. היעדר מערכת יעילה להערכת גנים הוא מכשול מרכזי לפענוח ישיר של גנטיקה תפקודית של טפילי קסטודה, כולל מיני אכינוקוק. המטרה העיקרית של עבודה זו הייתה להמחיש את התהליך של התמרה וקטורית לנטי-ויראלית אשר תהיה קריטית במחקר עתידי של אכינוקוקוזיס.
התוצאות מראות כי תולעים סטרובילגיות מגיבות יותר להתמרה חולפת של הגן מאשר הפרוטוסקולקסים, מה שעשוי להיות תוצאה של מבנה טגמנטלי נרחב בצורות הסטרובינציה. עם זאת, בשל אופיה של התמרה לנטי-ויראלית, עוצמת הפלואורסצנציה בפרוטו-מולקולות הרב-תאיות ובתולעים הסטרוביליות היא בדרך כלל נמוכה בהרבה מתאי HEK חד-שכבתיים יותר. יש צורך דחוף במחקר גנטי יישומי ברמה הגנומית והתעתיקית עבור אכינוקוק, כמו גם במגוון רחב של מערכות מודלים של תולעים שטוחות טפיליות וחופשיות.
לכן, פיתוח תהליך העברת הגנים לתולעי סרט סולל את הדרך לשימוש פוטנציאלי בטכניקות החדשות כגון מיפוי גנים מבוסס וירוסים או עריכת גנים בתיווך CRISPR-Cas9. עבודה זו מציגה התמרה לנטי-ויראלית במודל של תולעת סרט ומדגימה תוצאות מבטיחות בעלות השלכות פוטנציאליות על הביולוגיה של התולעים השטוחות. עם זאת, נדרשים מחקרים מעמיקים יותר כדי לשפר את השיטות ולפתח את הישימות של טכניקות אלה לניסויים עתידיים.
