Echinococcus granulosus'un strobilated formlarının geçici işlemi. Üçüncü nesil lentiviral vektörler kullanılarak Echinococcus granulosus'un farklı gelişim evrelerinde hızlı geçici transdüksiyon tekniğini tanımladık. Kistik ekinokokkozis veya hidatik hastalık, köpeklerin bağırsağında bulunan küçük bir tenya olan Echinococcus granulosus'un neden olduğu en önemli zoonotik paraziter hastalıklardan biridir.
Patogenez, hastalık kontrol ve korunma mekanizmalarını anlamak için uygulanan genetik araştırmalara acil ihtiyaç vardır. Bununla birlikte, etkili bir gen değerlendirme sisteminin olmaması, Echinococcus türleri de dahil olmak üzere cestod parazitlerinin fonksiyonel genetiğinin doğrudan yorumlanmasını engellemektedir. Parazitik yassı solucanlarda gen transferindeki ilerlemeler, protozoan parazite kıyasla hala sınırlıdır.
Viral dağıtım sisteminin kullanımı, son yirmi yılda transgen iletimi ve gen / protein araştırması için gerekli bir araç olarak ortaya çıkmıştır. Bu nedenle, GFP muhabir geninin Echinococcus granulosus'un protoskoleslerine ve strobilated solucanlarına lentiviral geçici transdüksiyonunu değerlendirdik. Şekil 1, Echinococcus granulosus evreleri için çalışma protokolünün şematik bir sunumunu göstermektedir.
Birincisi, kist hidatik toplamak. Bir mezbahada rutin olarak kesilen doğal olarak enfekte olmuş koyunlardan karaciğer hidatik kistlerini toplayın. Protoscoleces'i aspire etmeden önce steril gazlı bez ve% 70 alkol kullanarak kist yüzeyini tamamen sterilize edin.
20 ila 50 mL hidatik sıvıyı steril 50 mL konik tüplere aspire edin. Boşalttıktan sonra, kisti keskin bir bıçakla temizleyin, germinal tabakayı steril bir 50 mL konik tüpe aktarın ve protoscoleces koleksiyonunu arttırmak için kısa bir süre çalkalayın. Protoscoleces PBS tamponu ile üç ila beş kez yıkayın.
Bir ışık mikroskobu altında protoscoleces'in yaşayabilirliğini belirlemek için protoscoleces'i beş dakika boyunca% 0.1 eozin içinde gözlemleyin. Kültür için en az% 95 canlılığa sahip protoscoleces kullanın. Protoscoleces çökeltiyi 15 ila 20 dakika boyunca iki mL pepsin ile tedavi edin.
Bireysel protoscoleces'i izole etmek için, protoscoleces tortusunu PBS'de yeniden askıya alın ve iki kat steril gazlı bezden yeni bir steril 50 mL konik tüpe geçirin. İki, yetişkin solucanlar elde etmek için Echinococcus granulosus'un protoskoleslerinin bifazik yetiştiriciliği. Her 25 santimetrekarelik kültür şişesine 10 mL sıvı faz ortamı ekleyin.
Kültür şişesine yaklaşık 5.000 protoscoleces ekleyin ve CO2 inkübatörüne aktarın. 24 ila 48 saat sonra, protoskolleri katı fazlı yeni bir şişeye aktarın ve şişe başına aynı taze sıvı faz ortamından bir mL ekleyin. Şişeleri inkübatöre, 37 santigrat derece,% 5 CO2'ye aktarın.
Her beş ila yedi günde bir, ortamı taze sıvı faz ortamı ile değiştirin. Üç, bir Echinococcus granulosus'un protoskoleslerinin monofazik yetiştiriciliği. Monofazik ekimin transdüksiyondan 24 ila 48 saat önce yapıldığından emin olun.
Kültür RPMI ve% 10FBS ile 25 santimetrekare kültür şişesinde yaklaşık 5.000 protoskosel. Şişeleri kullanana kadar CO2 inkübatörüne aktarın. Dört, virüs üretimi ve hazırlanması için hücre kültürü.
500.000 HEK hücresini,% 10 FBS, 100 U / mL penisilin ve 100 mikrogram / mL streptomisin içeren 5 mL DMEM içeren 25 santimetre karelik bir şişeye aktarın. HEK2 hücrelerini% 5 CO2'de 37 santigrat derecede inkübe edin ve her 48 saatte bir tam kültür ortamında geçirin. Son olarak, transdüksiyon için düşük pasajlı HEK hücrelerini kullanın.
Beş, üçüncü nesil lentiviral vektörlerle virüsün üretimi ve hazırlanması. İlk gün, HEK hücrelerini 6 kuyucuklu bir kültür plakasında tripsinize ettikten sonra,% 10 FBS içeren taze antibiyotiksiz DMEM ile kuyu başına 70.000 hücre tohumlayın. Kalsiyum fosfat yöntemiyle transdüksiyon için% 50 ila% 60 akıcılıkta hücreler kullanın.
İkinci gün, deneyden iki ila üç saat önce hücre kültürü ortamını% 2 FBS içeren taze antibiyotik içermeyen DMEM ile değiştirin. 1,5 mL'lik bir tüpte, 7 mikrogram / mikrolitre pCDH513b transfer vektörü, 4 mikrogram / mikrolitre PLPII, 4 mikrogram / mikrolitre PLPI ve 2 mikrogram / mikrolitre PMD2G yardımcı vektörleri dahil olmak üzere üçüncü nesil lentiviral plazmidleri karıştırın. 422 mikrolitre hacme ulaşmak için karışıma HEPES tamponu ekleyin.
Karışıma 16 mikrolitre% 1 TE tamponu ekleyin. Tüplere 62 mikrolitre 2,5 mL kalsiyum klorür ekleyin ve iyice karıştırın. Karışıma 500 mikrolitre 2x HBS tamponu ekleyin, bir Pasteur pipet kullanarak bir ila iki dakika içinde damla damlatın.
Yarı opak bir çözelti elde edilene kadar hafifçe karıştırın ve karışımı oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edin. Sonunda, karışımı her plakaya yavaşça ekleyin ve yavaş dairesel hareketlerle dağıtın. Plakaları% 5'lik bir CO2 inkübatöründe 37 santigrat derecede inkübe edin ve dört ila altı saat sonra ortamı% 10 FBS içeren antibiyotiksiz DMEM ile değiştirin.
Üçüncü gün, ters çevrilmiş bir floresan mikroskobu kullanarak başarılı geçici transdüksiyonu ve hücre canlılığını onaylayın. Dördüncü gün, her bir kuyucuğun süpernatantını toplayarak virüsleri kültür ortamından toplayın ve kullanıma kadar negatif 70 santigrat derecede saklayın. Echinococcus granulosus'un farklı aşamalarının virüs ile altı, geçici transdüksiyonu.
İlk gün, gen transferi için 12 kuyucuklu bir kültür plakası kullanın. Kültür 5.000 ila 50.000 HEK hücresi, iç referans olarak tam bir DMEM ortamı ile üçlü olarak. Kültür RPMI ve% 10 FBS'de üçlü olarak 150 taze protoskolek.
Kültür 30 strobilated solucanlar DMEM ve% 10 ısı ile inaktive FBS'ye üçlü olarak bölünür. HEK hücrelerini ve solucanın farklı aşamalarını dönüştürmek için dört mikrogram / mL transfeksiyon reaktifi ile 1 milyon virüsün bir karışımını hazırlayın. Karışımı her plakaya yavaşça ekleyin ve yavaş dairesel hareketlerle dağıtın.
Plakaları bir CO2 inkübatöründe dört ila altı saat boyunca inkübe edin, 37 santigrat derece, % 5 CO2. Transfeksiyon reaktiflerinin toksik etkilerini en aza indirmek için her numunenin ortamını aynı tam kültür ortamıyla değiştirin. İkinci gün, HEK hücreleri, protoskoleksler ve strobillenmiş solucanlar için geçici transdüksiyonun verimliliğini artırmak için önceki iki adımı tekrarlayın.
Tüm plakaları, hücre ortamının türüne bağlı olarak aynı kültür koşullarına sahip bir CO2 inkübatöründe 24 ila 48 saat boyunca inkübe edin. Üçüncü gün, floresan mikroskobu kullanarak transdüksiyonun başarılı olduğundan emin olun. Temsili sonuçlar.
Burada üçüncü nesil lentiviral vektörler kullanılarak Echinococcus granulosus'ta hızlı ve etkili bir geçici transdüksiyon tekniği tanımlanmıştır. Önceki çalışmalarımıza göre strobillenmiş solucanlar elde etmek için bifazik kültür ortamlarında protoscoleces kültürledik. Protoscoleces, altı haftalık bir in vitro kültürden sonra strobillenmiş solucanlara dönüşür.
Bifazik kültür ortamında Echinococcus granulosus'un farklı evreleri gözlenmiştir, bunlar arasında invaginated protoscoleces, Şekil 2A, evaginated protoscoleces, Şekil 2B ve birinci ve üçüncü proglottid formasyonlu strobilated solucanlar, Şekil 2C ile E.Protoscoleces ve sırasıyla monofazik ve bifazik ekimlerden elde edilen strobilated solucanlar GFP eksprese eden lentivirüsler tarafından transfekte edilmiştir, Şekil 3. HEK hücreleri, GFP'yi geçici transdüksiyon süreci kontrolü olarak açıkça ifade etti. Yetişkin solucanlar GFP'yi tegumental tabakada en belirgin şekilde ifade ettiler.
Bununla birlikte, protoskoleces 48 saat sonra biraz daha düşük bir GFP ekspresyonu seviyesi göstermiştir. Protoskolekslerin etrafındaki bazı kist sıvı kalıntıları ve/veya germinal tabaka kalıntıları, transfekte edilen örneklerde bazı floresan arka plana neden olmuştur. HEK hücrelerinde ve strobillenmiş solucanlarda floresan yoğunluğu 24 ve 48 saat sonra artmıştır.
Nematodların moleküler temelini ve Platyhelminthes biyolojisini anlamak, zoonotik parazitlerin patojenitesindeki en önemli sınırlardan biridir. Etkili bir gen değerlendirme sisteminin olmaması, Echinococcus türleri de dahil olmak üzere cestod parazitlerinin fonksiyonel genetiğinin doğrudan yorumlanmasının önündeki en büyük engeldir. Bu çalışmanın temel amacı, gelecekteki Ekinokokkoz araştırmalarında kritik olacak olan lentiviral vektör transdüksiyonu sürecini göstermekti.
Sonuçlar, strobillenmiş solucanların, genin geçici transdüksiyonuna protoscoleces'ten daha duyarlı olduğunu göstermektedir; bu, strobilated formlardaki geniş tegumental yapının bir sonucu olabilir. Bununla birlikte, lentiviral transdüksiyonun doğası gereği, çok hücreli protoskoleksler ve strobillenmiş solucanlardaki floresan yoğunluğu tipik olarak tek katmanlı HEK hücrelerinden çok daha düşüktür. Echinococcus için genomik ve transkriptomik seviyelerde uygulamalı genetik araştırmalara ve çok çeşitli parazitik ve serbest yaşayan yassı solucan model sistemlerine acil ihtiyaç vardır.
Bu nedenle, tenyalara gen transfer sürecinin geliştirilmesi, virüs tabanlı gen haritalama veya CRISPR-Cas9 aracılı gen düzenleme gibi yeni tekniklerin potansiyel kullanımının yolunu açmaktadır. Bu çalışma, bir tenya modelinde lentiviral transdüksiyonu sunmakta ve yassı solucan biyolojisi için potansiyel etkileri olan umut verici sonuçlar göstermektedir. Yine de, yöntemleri iyileştirmek ve bu tekniklerin gelecekteki deneyler için uygulanabilirliğini geliştirmek için daha derinlemesine çalışmalara ihtiyaç vardır.
