يحدد هذا البروتوكول خطوات إحداث التهاب عيني موثوق وقوي باستخدام المتفطرات المقتولة بالحرارة في نموذج الفأر. يمكن أن يساعد نموذج التهاب العنبية المتفطر هذا في دراسة آليات التهاب العين المناعي المزمن الذي يتطور بعد عدوى المتفطرات. لا يتطلب هذا النموذج من التهاب القزحية المزمن استخدام سلالات معينة من الفئران أو التحصين باستخدام مستضدات العين.
يسهل هذا النموذج استخدام خطوط الماوس المعدلة وراثيا والجينية في الدراسات الميكانيكية للتسبب في التهاب العين. سيكون نموذج PMU هذا مفيدا في الدراسات التي تختبر علاجات جديدة لالتهاب العين أو التهاب القزحية لدى البشر. يمكن اختبار العلاجات مثل قطرات العين الجديدة أو عوامل تعديل المناعة التي يتم إعطاؤها بشكل منهجي للتأكد من فعاليتها مع هذا النموذج.
سيسهل هذا النموذج دراسة كيفية تغيير مستضدات البكتيريا الفطرية المقتولة بالحرارة للبيئة المكروية لعضو مناعي متميز مثل العين. يمكن أن توفر هذه النتائج أيضا رؤى حول كيفية تأثير أنواع أخرى من عدوى العين على العين أو كيفية استجابة المواقع المناعية المتميزة ، مثل الدماغ ، لمستضدات البكتيريا الدقيقة. للبدء ، قم بفك جسم وحدة محول Sonicator وتنظيف المسبار بمسحة كحول بنسبة 70٪.
ثم قم بتشغيل Sonicator واضبط إعداد الطاقة على أربعة عن طريق تدوير مقبض التحكم في الطاقة. بعد ذلك ، لتوليد تعليق دقيق للبكتيريا السلية H37Ra في برنامج تلفزيوني ، اغمر طرف المسبار في مسحوق البكتيريا الدقيقة المحتوي على PBS. قم بتسخين الخليط على الثلج لمدة 30 ثانية ، ثم توقف لمدة 30 ثانية وكرر لمدة خمس دقائق لتفريق المسحوق بالكامل في تعليق متساو دون تسخين السائل.
بعد ذلك ، أضف 2.5 ملليلتر من مساعد Freund's Incomplete إلى الخليط ، وكرر عملية الصوتنة على الثلج حتى يشكل المستحلب تناسقا يشبه معجون الأسنان. للحقن تحت الجلد ، قم بتحميل 200 إلى 300 ميكرولتر من مستحلب البكتيريا الدقيقة في حقنة ملليلتر واحد. اطرد الهواء من المحقنة واستمر في ملء المحقنة بقلب متقطع والنقر حتى تمتلئ.
بعد ذلك ، ضع الحقن تحت الجلد إما على السطح الظهري للوركين أو على السطح البطني للساقين القريب من منطقة الغدد الليمفاوية الأربية لفأر C57 الأسود 6J المخدر من 6 إلى 10 أسابيع. أدخل الإبرة بعناية ، مع الحرص على عدم اختراق العضلات ، وحقن 50 ميكرولتر من المستحلب في الفضاء تحت الجلد. لا تقم بإزالة الإبرة على الفور للسماح بحقن المستحلب السميك بالكامل.
لتحضير مخزون المستضد للحقن داخل الجسم الزجاجي ، قم بصوتنة H37Ra في محلول PBS كما هو موضح سابقا ، ثم قم بتقسيم المحلول في أحجام 100 ميكرولتر وتخزينه عند 20 درجة مئوية. في يوم الحقن ، بعد التأكد من عمق التخدير العام ، قم بتخدير القرنية بقطرة واحدة من 0.5٪ من التتراكائين وتوسيع التلميذ بقطرة واحدة من 2.5٪ فينيليفرين. بعد التخلص من السوائل الزائدة ، أضف قطرة واحدة من 5٪ Betadine على سطح العين والشعر المحيط لتقليل خطر الإصابة بالتهاب باطن المقلة .
بعد دقيقتين إلى ثلاث دقائق ، قم بإزالة Betadine وقم بتغطية العين بجل هيدروكسي بروبيل ميثيل ميثيل ملون بنسبة 0.3٪ لمنع الجفاف تحت التخدير وتشكيل إعتام عدسة العين. بعد ذلك ، قم بتحميل حقنة سعة 10 ميكرولتر بمزيج المستضد والفلوريسئين ، ثم ضع الماوس في وضع الانبطاح على المنصة واستخدم قضبان الأذن اليمنى واليسرى لإصلاح رأس الماوس. ضع الماوس ووجهه تحت المنظار بحيث يكون الجانب الأنفي العلوي للعين اليمنى مرئيا.
ثم ، باستخدام إبرة قياس 30 ، قم بإزاحة الرموش ، وكشف الصلبة ، وتصور الحافة والأوعية الدموية الكعبرية. بعد ذلك ، باستخدام إبرة قياس 30 معقمة ، قم بعمل ثقب توجيه في الصلبة من واحد إلى ملليمترين خلف الليمبوس. بعد ذلك ، أدخل إبرة القياس 34 المرفقة بحامل الحقن في العين ، من خلال فتحة التوجيه ، بزاوية تتجنب العدسة ، ولكن ضع طرف الإبرة في التجويف الزجاجي.
باستخدام وحدة تحكم مضخة حقنة صغيرة ، قم بحقن ميكرولتر واحد بعناية من مستخلص M.tuberculosis في التجويف الزجاجي. في حالة الارتجاع المستمر ، قم بزيادة حجم الحقن إلى 1.5 ميكرولتر لضمان توصيل الجرعة الكافية. تأكد من وضع الجسم الزجاجي عن طريق تصور منعكس أخضر في العين ، وبعد 10 ثوان ، قم بإزالة الإبرة من العين.
بعد تخدير الفأر ، قم بتوسيع التلميذ بقطرة واحدة من 2.5٪ فينيليفرين ، وتجنب القطرات الزائدة التي تدخل الأنف أو الفم. بعد دقيقتين إلى ثلاث دقائق ، انزع السائل الزائد وقم بتغطية العين بجل هيدروكسي بروبيل ميثيل سيلوز بنسبة 0.3٪. بعد ذلك ، لف الماوس في طبقة من الشاش الجراحي للحفاظ على دفء الجسم ، ثم ضع الماوس على كاسيت الحيوان وضع الرأس مع شريط العض.
للحصول على التصوير المقطعي للتماسك البصري أو صور OCT ، قم بتشغيل نظام التصوير OCT وافتح برنامج التصوير. بالنسبة لتصوير الغرفة الخلفية ، اجعل OCT قريبا من سطح العين ، مع الحرص على عدم ملامسة سطح العدسة للعين. بمجرد وضع العين بشكل صحيح ، أوقف الفحص السريع ، وحدد بروتوكول مسح وحدة التخزين ، وقم بتنشيط الفحص باستخدام خيار الهدف.
بالنسبة لصور المقطع الخلفي، اضبط حتى يتمركز العصب البصري في صورة محاذاة المسح الأفقي B ، ويتم محاذاة شبكية العين مع محور المحاذاة الرأسية. بالنسبة لصور المقطع الأمامي، اضبط الموضع لتوسيط قمة القرنية في كل من صورة محاذاة المسح B الأفقية وصورة محاذاة المسح B العمودية. أخيرا ، انقر فوق لقطة لالتقاط صورة مسح وحدة التخزين ، ثم انقر فوق حفظ.
بعد 24 ساعة من الحقن داخل الجسم الزجاجي ، تظهر الخلايا الالتهابية في الماء والزجاج. تظهر وذمة القرنية ، ونقص ضغط الدم ، والعديد من الخلايا الالتهابية العائمة في الغرفة الأمامية ، والتهاب الجسم الزجاجي في الغرفة الخلفية. يمكن تسجيل درجة التهاب العين على صور OCT هذه.
تمثل الدرجات المجمعة الأكبر من الصفر ولكن أقل من 2.5 التهابا خفيفا. درجات أكبر من 2.5 ، ولكن أقل من 4.5. تمثل التهابا معتدلا ، وعشرات أكبر من 4.5 تحدد الالتهاب الشديد.
يمكن أيضا تحديد درجات الالتهاب باستخدام خمس خصائص مرئية في أقسام بقع الهيماتوكسيلين والإيوزين. يتم تحديد درجة الخطورة عن طريق حساب عدد الخلايا الالتهابية في الماء والزجاجي. يمكن لتصوير قاع العين الطولي في برايتفيلد أيضا تحديد التهاب الشبكية وحول الأوعية الدموية.
تظهر العيون الملتهبة بشدة تسلل أبيض متعدد في شبكية العين وتعرج الأوعية الدموية في تصوير قاع العين الملون ، بالإضافة إلى التهاب الزجاج الكثيف وذمة الشبكية في OCT في اليوم الثاني. تظهر العيون الملتهبة بشكل معتدل آفات خطية أقل وأكثر سرية في قاع العين ، وعدد من الخلايا المتسللة في الفضاء الزجاجي. ضمان الاتساق أثناء الحقن تحت الجلد وداخل الجسم الزجاجي واتخاذ التدابير المناسبة لمنع تطور التهاب باطن المقلة المعدية هي الخطوات الرئيسية التي تساعد في تكرار هذا النموذج بنجاح.
يمكن استخدام التصوير بالتلألؤ الحيوي في الجسم الحي لتوصيف الالتهاب بينما يمكن إجراء فحوصات ما بعد الوفاة ، مثل تحليل التدفق الخلوي متعدد المعلمات لتحديد وقياس مجموعات الخلايا المناعية المتسللة. يمكن استخدام تحليل السيتوكينات وتسلسل mRNA والتصوير المناعي لتقييم أنماط التعبير الجيني والبروتيني أو تحديد مجموعات الخلايا المناعية في شبكية العين في التهاب العنبية. يوضح هذا البروتوكول كيفية إجراء الحقن القابلة للتكرار والمعقمة والحد الأدنى من الصدمة التي ستساعد الباحثين في المستقبل على الوصول إلى الفضاء داخل الجسم الزجاجي في الفئران.
سيلعب OCT أيضا دورا مهما في الكشف عن التهاب العين الذي يمكن تفويته عن طريق الفحص البصري لعيون التجارب الصغيرة.
