Este protocolo describe los pasos para inducir una inflamación ocular confiable y robusta utilizando micobacterias muertas por calor en el modelo de ratón. Este modelo de uveítis micobacteriana preparada puede ayudar a estudiar los mecanismos de la inflamación ocular crónica mediada por el sistema inmune que se desarrolla después de una infección micobacteriana. Este modelo de uveítis crónica no requiere el uso de cepas específicas de ratón o inmunización con antígenos oculares.
Este modelo facilita el uso de líneas de ratón transgénicas y genes knockout en estudios mecanicistas de la patogénesis de la inflamación ocular. Este modelo de PMU será útil en estudios que prueben nuevas terapias para la inflamación ocular o uveítis en humanos. Los tratamientos como las gotas para los ojos nuevos o los agentes inmunomoduladores administrados sistémicamente podrían probarse para determinar su eficacia con este modelo.
Este modelo facilitará el estudio de cómo los antígenos micobacterianos muertos por calor alteran el microambiente de un órgano inmune privilegiado como el ojo. Estos resultados también podrían proporcionar información sobre cómo otros tipos de infección ocular afectan el ojo o cómo los sitios privilegiados inmunes, como el cerebro, responden a los antígenos microbacterianos. Para comenzar, dessujete el cuerpo de la unidad convertidora Sonicator y limpie la sonda con un hisopo con alcohol al 70%.
A continuación, encienda el Sonicator y ajuste la configuración de energía a cuatro girando la perilla de control de alimentación. A continuación, para generar una suspensión fina de la microbacteria tuberculosis H37Ra en PBS, sumerja la punta de la sonda en el polvo microbacteriano que contiene PBS. Sonicar la mezcla en hielo durante 30 segundos, luego hacer una pausa durante 30 segundos y repetir durante un total de cinco minutos para dispersar completamente el polvo en una suspensión uniforme sin calentar el líquido.
A continuación, agregue 2,5 mililitros de adyuvante incompleto de Freund a la mezcla y repita el proceso de sonicación en hielo hasta que la emulsión forme una consistencia similar a la pasta de dientes. Para la inyección subcutánea, cargue de 200 a 300 microlitros de la emulsión microbacteriana en una jeringa de un mililitro. Expulse el aire de la jeringa y continúe llenándola con inversión intermitente y golpeteo hasta que se llene.
A continuación, coloque las inyecciones subcutáneas en la superficie dorsal de las caderas o en la superficie ventral de las piernas proximal a la región de los ganglios linfáticos inguinales de un ratón C57 negro 6J anestesiado de 6 a 10 semanas de edad. Inserte cuidadosamente la aguja, teniendo cuidado de no penetrar en el músculo, e inyecte 50 microlitros de la emulsión en el espacio subcutáneo. No retire la aguja inmediatamente para permitir que la emulsión espesa se inyecte completamente.
Para preparar el stock de antígenos para la inyección intravítrea, sonicar el H37Ra en solución de PBS como se demostró anteriormente, luego alícuota la solución en volúmenes de 100 microlitros y almacenar a 20 grados centígrados. El día de la inyección, después de confirmar la profundidad de la anestesia general, anestesiar la córnea con una gota de 0,5% de tetracaína y dilatar la pupila con una gota de 2,5% de fenilefrina. Después de frotar el exceso de líquido, agregue una gota de 5% de betadina a la superficie del ojo y al cabello circundante para disminuir el riesgo de endoftalmitis.
Después de dos o tres minutos, retire el Betadine y cubra el ojo con gel de hipromelosa al 0,3% para evitar la sequedad bajo anestesia y la formación de cataratas. A continuación, cargue una jeringa de 10 microlitros con la mezcla de antígeno y fluoresceína, luego coloque el mouse en posición prona en la plataforma y use las barras de oído derecha e izquierda para fijar la cabeza del mouse. Coloque y oriente el ratón debajo del endoscopio de modo que el aspecto nasal superior del ojo derecho sea visible.
Luego, usando una aguja de calibre 30, desplace las pestañas, exponga la esclerótica y visualice el limbo y el vaso sanguíneo radial. Luego, usando una aguja estéril de calibre 30, haga un orificio guía en la esclerótica de uno a dos milímetros posterior al limbo. Luego, inserte la aguja de calibre 34 conectada al soporte de inyección en el ojo, a través del orificio guía, en un ángulo que evite la lente, pero coloque la punta de la aguja en la cavidad vítrea.
Usando un controlador de bomba de micro jeringa, inyecte cuidadosamente un microlitro del extracto de M.tuberculosis en la cavidad vítrea. En caso de reflujo constante, aumente el volumen de inyección a 1,5 microlitros para garantizar la administración adecuada de la dosis. Confirme la colocación intravítrea visualizando un reflejo verdoso en el ojo y, después de 10 segundos, retire la aguja del ojo.
Después de anestesiar al ratón, dilate la pupila con una gota de fenilefrina al 2,5%, evitando que el exceso de gotas entre en la nariz o la boca. Después de dos o tres minutos, aplique el exceso de líquido y cubra el ojo con gel de hipromelosa al 0,3%. A continuación, envuelva al ratón en una capa de gasa quirúrgica para mantener el calor corporal, luego coloque el ratón en el casete del animal y coloque la cabeza con la barra de mordida.
Para adquirir la tomografía de coherencia óptica o las imágenes de OCT, encienda el sistema de imágenes de OCT y abra el software de imágenes. Para las imágenes de la cámara posterior, acerque la OCT a la superficie del ojo, teniendo cuidado de no poner la superficie del cristalino en contacto con el ojo. Una vez que el ojo esté correctamente posicionado, detenga el escaneo rápido, seleccione el protocolo de escaneo de volumen y active el escaneo con la opción Apuntar.
Para las imágenes del segmento posterior, ajuste hasta que el nervio óptico esté centrado en la imagen de alineación de la gammagrafía B horizontal y la retina esté alineada con el eje de alineación vertical. Para las imágenes del segmento anterior, ajuste la posición para centrar el ápice de la córnea tanto en la imagen de alineación horizontal de la exploración B como en la imagen de alineación vertical de la exploración B. Finalmente, haga clic en Instantánea para capturar la imagen de escaneo de volumen, luego haga clic en guardar.
24 horas después de la inyección intravítrea, se observan células inflamatorias en el acuoso y vítreo. El edema corneal, un hipopión y múltiples células inflamatorias flotantes se observan en la cámara anterior y vitritis en la cámara posterior. El grado de inflamación ocular se puede calificar en estas imágenes de OCT.
Las puntuaciones combinadas mayores que cero pero inferiores a 2,5 representan una inflamación leve. Puntuaciones superiores a 2,5, pero inferiores a 4,5. representan inflamación moderada, y puntuaciones superiores a 4,5 identifican inflamación grave.
Las puntuaciones de inflamación también se pueden determinar utilizando cinco características visibles en las secciones de tinción de hematoxilina y eosina. La puntuación de gravedad se determina contando el número de células inflamatorias en el acuoso y vítreo. Las imágenes longitudinales de fondo de ojo de campo claro también pueden identificar inflamación retiniana y perivascular.
Los ojos severamente inflamados demuestran múltiples infiltrados blancos en la retina y tortuosidad vascular en las imágenes de fondo de ojo en color, así como vitritis densa y edema retiniano en OCT en el segundo día. Los ojos levemente inflamados demuestran menos lesiones lineales y más discretas en el fondo de ojo, y un número de células infiltrantes en el espacio vítreo. Asegurar la consistencia durante las inyecciones subcutáneas e intravítreas y tomar las medidas adecuadas para prevenir el desarrollo de endoftalmitis infecciosa son los pasos clave que ayudan a replicar con éxito este modelo.
Las imágenes de bioluminiscencia in vivo se pueden utilizar para caracterizar la inflamación, mientras que los ensayos post mortem, como el análisis citométrico de flujo multiparamétrico, se pueden realizar para identificar y cuantificar poblaciones infiltrantes de tipo de células inmunes. El análisis de citoquinas, la secuenciación del ARNm y las imágenes de inmunofluorescencia se pueden utilizar para evaluar los patrones de expresión de genes y proteínas o identificar poblaciones de células inmunes de la retina en la uveítis. Este protocolo muestra cómo realizar inyecciones reproducibles, asépticas y mínimamente traumáticas que ayudarán a los futuros investigadores a acceder al espacio intravítreo en ratones.
La OCT también desempeñará un papel importante en la detección de la inflamación ocular que de otro modo podría pasarse por alto mediante un examen visual de los ojos de pequeños animales de experimentación.
